神經(jīng)細胞凋亡與腦缺血疾病

宋修云，胡金鳳，陳乃宏

(天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京 100050)

腦缺血性疾病是嚴重危害人類健康的常見病和多發(fā)病。近幾十年的研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血后的幾個小時內(nèi)，缺血半暗帶或梗死區(qū)周圍的神經(jīng)元死亡主要以凋亡性死亡為主。也就是說腦缺血損傷與細胞凋亡的關(guān)系非常密切，因此腦缺血后神經(jīng)細胞凋亡機制的探索以及基于抗凋亡為靶點的抗腦缺血研究成為研究的熱點。本文主要綜述了腦缺血后神經(jīng)細胞凋亡通路、通路中重要的凋亡蛋白和基因，以及相關(guān)的抗腦缺血研究進展。

1 腦缺血損傷與神經(jīng)細胞凋亡

已有研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦中風(fēng)發(fā)生早期，缺血中心區(qū)腦血流急劇下降，神經(jīng)細胞死亡以壞死為主;而缺血中心區(qū)周圍(缺血半暗帶)的神經(jīng)細胞仍然具有代謝活力，其后續(xù)的死亡以凋亡為主，其形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為核固縮、胞膜發(fā)泡及凋亡小體的形成，DNA在寡核小體間裂解，在凝膠電泳時呈現(xiàn)明顯的“DNA Ladder”［1］。我們在研究大鼠局灶性腦缺血模型中，發(fā)現(xiàn)單側(cè)頸總動脈閉塞1 h、再灌注24 h后，缺血側(cè)腦皮層、海馬及紋狀體均出現(xiàn)嚴重的神經(jīng)細胞凋亡，與多數(shù)文獻報道相一致，進一步說明神經(jīng)細胞凋亡與腦缺血具有密切的關(guān)系。因此，對缺血半暗帶神經(jīng)細胞的“搶救工作”可以成為抗腦缺血治療的重要手段。眾多研究顯示，腦缺血后興奮性氨基酸毒性、自由基和NO的損傷以及免疫炎癥效應(yīng)等，是介導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡的主要因素。腦缺血后介導(dǎo)凋亡的通路主要為Caspase(Cyteingl aspirate-specific proteinase，半胱天冬酶家族)依賴的凋亡通路——線粒體介導(dǎo)的凋亡通路和死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路，以及近幾年人們開始關(guān)注的非Caspase依賴的凋亡通路。

2 神經(jīng)細胞凋亡通路

2.1 線粒體介導(dǎo)的凋亡通路 線粒體內(nèi)部儲存著大量凋亡相關(guān)蛋白，例如，細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)、凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor，AIF)、蛋白質(zhì)線粒體第二啟動子Caspase/凋亡抑制蛋白直接結(jié)合蛋白(Smac/DIABLO)、核酸內(nèi)切酶 G(endonuclease G)以及 procaspase-2、-3、-8、-9等［2］。DNA損傷、線粒體膜流動性降低、生長因子匱乏均可以啟動線粒體依賴的凋亡通路，導(dǎo)致相關(guān)蛋白的釋放。

當(dāng)細胞受到各種因素(如缺血、缺氧等)刺激后，細胞內(nèi)部發(fā)生一系列的病理改變，其中之一就是線粒體膜去極化，線粒體膜電位下降，通透性轉(zhuǎn)變孔開放，procaspase-9、Smac/DIABLO和CytC等從線粒體釋放出來。一方面，Cyt C、procaspase-9與凋亡活化因子-1(apoptotic protease-activating factor 1，Apaf-1)在dATP/ATP存在的情況下，形成凋亡體，激活Caspase-9，繼而活化下游Caspase-3，引起細胞凋亡［3］。另一方面，Smac/DIABLO拮抗活化的Caspase-9與凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis proteins，IAP)的結(jié)合，進而解除凋亡抑制，加速Caspase-3的活化，介導(dǎo)細胞凋亡［4］。

2.2 死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路 細胞表面的死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)超家族成員。其胞外區(qū)都有富含半胱氨酸的區(qū)域，胞質(zhì)區(qū)有一由同源氨基酸殘基構(gòu)成的結(jié)構(gòu)，具有蛋白水解功能，稱死亡結(jié)構(gòu)域(death domain，DD)。目前已知的死亡受體有5種，TNFR-1、Fas(CD95)、DR3(death receptor 3)、DR4(death receptor 4)、DR5(death receptor 5)。目前研究比較清楚的是Fas-Fas-L信號傳導(dǎo)途徑和TNFR信號傳導(dǎo)途徑［1，5］。

Fas-L是一個同源三聚體，每個三聚體分子結(jié)合一個Fas分子，一旦與三聚體的配體相結(jié)合，F(xiàn)as通過胞內(nèi)段的DD募集胞質(zhì)中的 FADD(Fas-associated death domain)，F(xiàn)ADD氨基端含有一個DED(death effect domain)，此DED與Caspase-8原域中的DED相互作用，把Caspase-8募集到Fas區(qū)域，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體(death-inducing signaling complex，DISC)，進而激活 Caspase-8，啟動 Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致

TNF通過兩種細胞表面受體TNFR-Ⅰ和TNF-Ⅱ介導(dǎo)生物學(xué)活性。TNFRs不具有酶解活性，但可募集其它分子轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。當(dāng)與TNF結(jié)合后TNFR-Ⅰ三聚體化，然后募集一個銜接蛋白TRTDD(TNF receptor-associated death domain)，TRTDD再募集其它幾個銜接分子 FADD，TRAF-2(TNFR-associated factor-2)和RIP。RIP和TRAF-2激活后，導(dǎo)致NF-κB降解、釋放、轉(zhuǎn)位至核，激活一系列基因表達，凋亡發(fā)生;FADD通過募集和活化Caspases啟動凋亡通路。

2.3 非Caspase依賴性凋亡通路——PARP-1/AIF通路近年研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后除以上提到的兩種凋亡通路外，還存在Caspase非依賴的凋亡通路，如PARP-1［poly-(ADP-ribose)-polymerase］/AIF介導(dǎo)的凋亡通路［5］。生理條件下，PARP-1參與DNA損傷修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白降解等。在經(jīng)典的細胞凋亡途徑中，PARP-1為Caspase切割底物，后者將其切割為片段，從而抑制其DNA修復(fù)功能，避免細胞內(nèi)ATP耗竭，保證凋亡過程中的能量供應(yīng)［6］。然而，PARP-1并不僅僅作為死亡底物被動地參與細胞凋亡，PARP-1過度激活能引起細胞能量消耗劇增，另外Poly(ADP-ribose)能導(dǎo)致線粒體釋放AIF進入細胞質(zhì)、而后很快轉(zhuǎn)位至核，誘發(fā)細胞呈現(xiàn)染色質(zhì)凝集、DNA片段化和磷脂酰絲氨酸外翻等凋亡特征，此為非Caspase依賴的細胞凋亡［7］。

3 基于抗凋亡為靶點的抗腦缺血研究

3.1 Caspase家族與抗腦缺血研究 Caspase是導(dǎo)致凋亡解體的蛋白酶家族，在線粒體和死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路中執(zhí)行細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了該家族的14 個成員，其中直接參與凋亡的有 Caspase-2、3、6、7、8、9、10。腦缺血后［1，8］，神經(jīng)元發(fā)生凋亡經(jīng)線粒體介導(dǎo)的凋亡通路時，Caspase-9被激活;經(jīng)死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路時，Caspase-8被激活。Caspase-8或 Caspase-9均可使 Procaspase-3裂解，產(chǎn)生具活性Caspase-3，進而酶解切割特異性底物PARP、DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PK)、類固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白(SREPB)等，導(dǎo)致細胞凋亡。

大量針對Caspase的藥物抑制或基因干預(yù)，均可改善實驗性腦缺血損傷。p35可非選擇性抑制 Caspase-1、-3、-6、-7、-8、-10，CrmA 可選擇性抑制 Caspase-1、-8。Sung 等［9］將實驗性大鼠分3組分別雙側(cè)腦室注射載體病毒，載體病毒分別攜帶空質(zhì)粒、p35質(zhì)粒和CrmA質(zhì)粒，12～16 h后雙側(cè)頸總動脈閉塞48 h，斷頭取腦，發(fā)現(xiàn)p35可明顯提高缺血半暗區(qū)X-gal陽性神經(jīng)細胞存活，抑制Caspase-3及Cyt C的表達，CrmA組雖也有提高神經(jīng)細胞存活的趨勢，但差異無顯著性。分析原因可能為p35不僅抑制線粒體介導(dǎo)的凋亡通路，還可抑制死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路，而CrmA抑制Caspase-8，僅對死亡受體通路具有抑制作用。Hatip-Al-Khatib等［10］采用四血管夾閉10 min，灌注60 min，再缺血10 min的重復(fù)性全腦缺血方法造模，發(fā)現(xiàn)第1次夾閉后雙側(cè)腦室注射8.4 μg Caspase-3抑制劑Ac-DEVD-CHO，可將大鼠大腦CA1區(qū)神經(jīng)細胞的存活率上升到58%。另外，針對Caspase-8，Caspase-3具有抑制作用的中醫(yī)針灸療法對實驗性腦缺血也有改善作用［11］。

3.2 Bcl-2家族與抗腦缺血研究 Bcl-2蛋白家族包括Bcl-2樣促生存亞家族(Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w等)和Bcl-2樣促凋亡亞家族。后者可進一步分為Bax樣促凋亡亞家族(Bax、Bak、Bcl-xS等)和 BH3 區(qū)域蛋白亞家族(Bad、Bid、Bim and PUMA等)。目前研究證明，Bcl-2蛋白家族主要參與線粒體介導(dǎo)的凋亡通路和非Caspase依賴的凋亡通路。在正常細胞中，Bcl-2樣促生存亞家族蛋白和Bax樣促凋亡亞家族蛋白處于平衡狀態(tài)，不發(fā)生凋亡。凋亡刺激下，BH3區(qū)域蛋白亞家族蛋白能與Bcl-2樣促生存亞家族蛋白成分形成的凹槽結(jié)合，置換出Bax樣促凋亡亞家族，后者轉(zhuǎn)位并潛入到線粒體，使線粒體膜通透性增強，導(dǎo)致細胞色素C和AIF的釋放，進而引發(fā)細胞凋亡［12］。其中研究最多且最重要的是Bcl-2和Bax。Bcl-2通過阻斷細胞凋亡而促進細胞存活，維持細胞生存，而Bax與Bcl-2功能相反，誘導(dǎo)細胞凋亡。因此，Bcl-2與Bax的比值變化決定細胞的凋亡與生存。

幾十年來，國內(nèi)外學(xué)者針對Bcl-2家族成員做了大量抗腦缺血損傷的研究。轉(zhuǎn)入Bcl-2或Bcl-xL基因，可減少神經(jīng)細胞凋亡，并可預(yù)防海馬CA1區(qū)錐體細胞凋亡，而敲除Bcl-2基因，可明顯增加腦缺血梗死面積。吉海杰等［13］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠口服甲氧基歐芹酚3周，可明顯抑制雙側(cè)頸總動脈永久性閉塞所致海馬區(qū)神經(jīng)元丟失，提高認知功能，其機制可能是通過下調(diào)Bax/Bcl-2的比值實現(xiàn)的。Bazan［14］發(fā)現(xiàn)缺血/再灌注同時給予神經(jīng)保護劑NPD1，可明顯抑制凋亡細胞DNA損傷，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL表達，下調(diào)凋亡蛋白Bax、Bad的表達，減少神經(jīng)細胞凋亡。王繼生等［15］發(fā)現(xiàn)茅莓總皂苷可明顯減輕缺血2 h再灌24 h大鼠局灶性腦缺血后神經(jīng)元形態(tài)病理學(xué)改變，增加Bcl-2、降低Bax陽性細胞數(shù)。

3.3 p53基因與抗腦缺血研究 p53是促進細胞凋亡的重要基因，它通過激活一系列下游基因發(fā)揮促凋亡作用。p53的蛋白產(chǎn)物有野生型(wt-p53)和突變型(mt-p53)兩種。mtp53迄今只在腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)，wt-p53作為一種抗細胞增殖蛋白，可誘導(dǎo)腫瘤細胞和神經(jīng)元凋亡。

wt-p53在腦缺血中作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可調(diào)節(jié)其他細胞周期相關(guān)基因，如p21基因、Bax基因的表達，同時降低Bcl-2的表達，加速細胞凋亡［16］。Leker等［17］采用大鼠大腦中動脈閉塞2 h，再灌注48 h造模，檢測新型p53抑制劑pifithrinα的短暫性抗腦缺血損傷效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)再灌0 h和1 h靜脈給予pifithrinα，可明顯降低梗死體積和神經(jīng)行為學(xué)評分，降低 TUNEL和Caspase陽性細胞數(shù)。其機制可能是pifithrin α通過降低p21基因表達抑制p53與其DNA位點結(jié)合，抑制后續(xù)的細胞凋亡。Park等［18］發(fā)現(xiàn)局灶性腦缺血前24 h靜脈給予基因調(diào)節(jié)劑氧化偶氮甲烷(AOM)可明顯降低梗死體積，缺血半暗帶較對照組p53陽性細胞數(shù)減少12%(P＜0.05)，p53陽性蛋白面積減少15.6%(P＜0.01)。同時，AOM對p21蛋白表達無影響。分析原因可能為AOM通過抑制p53的活化降低腦缺血損傷半暗帶神經(jīng)細胞的凋亡。

3.4 PARP與抗腦缺血研究 PARP是一個蛋白修飾酶超家族，對蛋白底物進行Poly(ADP-ribose)或者Mono(ADP-ri-bose)修飾，從而調(diào)節(jié)各種底物蛋白的功能。PARP超家族中，PARP-1和PARP-2在DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮重要功能，通過Poly(ADP-ribose)化蛋白修飾，調(diào)節(jié)組蛋白和各種修復(fù)酶的結(jié)構(gòu)和活性，使DNA損傷得以及時修復(fù)。但當(dāng)它們被過度激活時會消耗大量能量，從而使細胞由于能量消耗過度而凋亡或壞死。

腦缺血中研究較多的是PARP-1過度激活引起的非Caspase依賴的細胞凋亡。當(dāng)腦缺血發(fā)生后，由于缺血缺氧給細胞帶來的損傷及再灌注后的氧化應(yīng)激損傷，PARP-1被過度激活，引起受損細胞發(fā)生凋亡和壞死。因此通過抑制PARP-1活性，減慢神經(jīng)細胞DNA損傷修復(fù)的能量消耗，可以明顯減輕腦缺血損傷。PARP-1抑制劑作為抗腦缺血研究中的新星，越來越受到關(guān)注。Matsuura等［19－20］研究發(fā)現(xiàn)高效PARP-1抑制劑MP-124在多種動物模型中具有減輕腦缺血損傷的作用。MP-124在猴子pMCAO和tMCAO模型中，可以將腦梗死面積減少64%，并能明顯降低神經(jīng)行為學(xué)評分，使該化合物的抗腦缺血作用在非人靈長類動物中得到進一步肯定，該化合物即將進入臨床試驗。李琴等［21］研究發(fā)現(xiàn)胡黃連苷和丹參素可明顯降低大腦中動脈閉塞再灌注所致大鼠神經(jīng)行為功能障礙、缺血側(cè)半球梗死病灶體積、腦組織PARP、Caspase-3表達以及細胞凋亡數(shù)。其抑制凋亡的作用可能是通過抑制PARP及Caspase-3表達來實現(xiàn)的。

3.5 立早基因與抗腦缺血研究 立早基因(immediate early genes，IEGs)參與神經(jīng)細胞的信息傳遞、生長分化和損傷修復(fù)，研究較多的有c-fos和c-jun。正常情況下，c-fos與c-jun在神經(jīng)元中僅呈極低水平表達，而腦缺血與再灌注后即被快速而短暫地誘導(dǎo)表達。IEGs屬于核內(nèi)第三信使，腦缺血誘導(dǎo)IEGs表達后，產(chǎn)物fos、jun經(jīng)亮氨酸拉鏈，聯(lián)合為雜合二聚體，即轉(zhuǎn)錄因子AP1，特異性與DNA上AP1結(jié)合位點結(jié)合，調(diào)控細胞凋亡。

目前的研究還不能確定IEGs在腦缺血損傷初期的高表達是對凋亡的促進還是抑制。有學(xué)者認為，c-fos的高表達啟動晚期效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，促進凋亡。也有研究發(fā)現(xiàn)c-fos的早期表達增加能上調(diào)存活基因的表達而產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。Akaji等［22］檢測低溫治療對大鼠短暫性腦缺血/再灌注損傷的保護作用，發(fā)現(xiàn)相對于非低溫對照組，再灌注3 h后，低溫處理組皮層缺血半暗帶AP-1結(jié)合活力提高，c-fos表達上調(diào)，c-jun無變化，再灌48 h后皮層梗死體積降低。分析其機制可能是低溫刺激提升缺血/再灌注早期c-fos的基因表達，上調(diào)AP-1結(jié)合能力，延遲后續(xù)基因表達，更有利于神經(jīng)細胞存活。Herra等［23］發(fā)現(xiàn)免疫抑制劑FK506具有抑制細胞及動物水平缺血/再灌注損傷的作用，其機制可能為抑制凋亡信號通路中c-jun及Fas-L的表達。曲友直等［24］通過TUNEL染色發(fā)現(xiàn)中藥川芎嗪和黃芪對腦缺血/再灌注后腦組織神經(jīng)細胞均有保護作用，機制可能為兩藥均可抑制損傷后c-fos蛋白的高表達。

3.6 其它 另外，目前有許多學(xué)者通過藥物或基因?qū)IF、HSP(heat shoke protein)、Fos-L等因子進行調(diào)節(jié)，對實驗性腦缺血損傷后神經(jīng)細胞凋亡也有一定作用。

4 問題和展望

腦缺血損傷后神經(jīng)元凋亡是一個多途徑多因素的復(fù)雜病理過程，機制尚未完全清楚。目前國內(nèi)外對于腦缺血損傷以及抗腦缺血的研究很多。很多藥物在細胞及實驗動物模型上已見很好的療效，但臨床上抗腦缺血的藥物卻很少，療效并不很樂觀。主要原因［25］有3點:① 臨床腦缺血發(fā)生的不可預(yù)知性、發(fā)展的高速性、治療的滯后性;② 實驗性腦缺血研究指標(biāo)的局限性，如:藥效觀察大多著重于藥物減輕腦梗死面積的程度，而很少深度探究動物神經(jīng)學(xué)功能的變化;機制研究多關(guān)注個別蛋白或因子，缺少全面性;③ 臨床腦缺血病人情況的不可控性，如:臨床研究中，受試患者間個體差異較大、受試樣本量較小、損傷程度不一致。這就需要我們不斷總結(jié)前人經(jīng)驗，更深入地研究、了解腦缺血的病理機制。在腦缺血發(fā)生過程中，更好地完善、利用神經(jīng)細胞凋亡機制，篩選出更優(yōu)秀的抗腦缺血藥物。

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