乳酸桿菌對老齡小鼠T細胞膜型CD28和血清中可溶性CD28表達的影響

洪 亮 陳其御 王 萍 沈 強 (皖南醫(yī)學院微生物與免疫教研室，安徽 蕪湖 24002)

1995年德國科學家Graham Pawelec小組研究發(fā)現(xiàn)，T細胞表面與老化關系最密切的抗原分子是CD28分子。到目前為止，人們已經(jīng)基本公認CD28分子成為免疫老化的重要標志之一，其在人類CD8+T細胞和CD4+T細胞表面隨增齡而表達降低的證據(jù)可見于最近的一些報道中。CD28分子是表達在人類95%CD4+T細胞表面和50%CD8+T細胞表面的重要信號分子，主要參與T細胞的活化、增殖、分化及發(fā)揮免疫應答作用。其中外周血T細胞膜型CD28(mCD28)和血清中可溶性CD28(sCD28)的表達隨年齡的改變而不同。那么，益生菌是否通過改變CD28分子的數(shù)量和質量來達到抗衰老的目的呢?本文就乳酸桿菌對老齡小鼠T細胞mCD28的表達水平和血清中sCD28的含量進行定量分析，進一步在分子水平探討乳酸桿菌在抗衰老中的意義和作用，為免疫衰老機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)菌株 分別取凍干保存的Ⅱ型嗜酸乳酸桿菌株在MRS肉湯中復蘇增菌，并在固體培養(yǎng)基中接種生長，實驗時將培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基中的菌苔用PBS洗滌三次，并用麥氏比濁法調各乳酸桿菌濃度至1×1010cfu/ml濃度懸液備用。

1.2 選擇試驗動物 選取老齡KM小鼠(13～15月齡)80只，雌雄各半，飼養(yǎng)于普通環(huán)境中。其中每組再各隨機分為兩組，一組為試驗組，另一組為對照組，每組20只。試驗組每天每只老鼠腹腔注射乳酸桿菌0.2 ml/只，對照組每天每只老鼠腹腔注射生理鹽水0.2 ml/只，連續(xù)10 d。

1.3 標本采集 第11天處死小鼠，每只分別收集肝素抗凝及不抗凝的老齡小鼠外周血2 ml，抗凝血經(jīng)分離獲得單個核細胞，間接免疫熒光及流式細胞儀分析老齡小鼠T細胞mCD28的表達水平，ELISA檢測血清中sCD28的含量。

1.4 T細胞mCD28表達水平分析 常規(guī)淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，取一定量的細胞懸液(約1×106細胞/ml)，先加入CD28單抗溫育，待反應完全后洗去未結合抗體，再加入熒光標記的第二抗體，生成抗原-抗體-抗抗體復合物，用FCM檢測其上標記的熒光素被激發(fā)后發(fā)出的熒光。

1.5 血清中sCD28含量測定 選用自制CD28單抗8G8包被酶標檢測板，用3%BSA封閉。分別加入不同濃度的rhCD28/Fc融合蛋白(0～64 ng/ml)和待測血清，37℃反應2 h。充分洗滌后，再加入生物素標記的識別另一抗原表位的CD28單抗2D5和HRP標記的鏈霉親和素。洗滌后，加入TMB底物室溫反應15 min后終止反應，置酶標儀上測定OD。每個濃度做3個復孔。以標準品rhCD28/Fc融合蛋白的濃度為橫坐標，相應的OD值為縱坐標繪制標準工作曲線。根據(jù)待測樣本的OD值換算出相應的sCD28的含量。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.0軟件進行t檢驗。

2 結果

2.1 老齡鼠外周血T細胞mCD28的表達 經(jīng)間接免疫熒光及流式細胞儀分析，老齡鼠試驗組外周血T細胞mCD28的陽性表達率為:雄性(51.64±7.86)、雌性(53.00±5.40);老齡鼠對照組外周血T細胞mCD28的陽性表達率為:雄性(45.56±3.62)、雌性(47.48±2.59)。其中，同一組內雄性和雌性間比較均無顯著差異(P＞0.05);雄性試驗組和雄性對照組之間比較有差異(P＜0.05);雌性試驗組和雌性對照組之間比較有顯著差異(P＜0.01)。

2.2 老齡鼠血清中T細胞sCD28的表達 雄性(0.68±0.20)、雌性(0.73±0.22);老齡鼠對照組血清中T細胞sCD28的含量為:雄性(1.36±0.29)、雌性(1.45±0.27)。其中，同一組內雄性和雌性間比較均無顯著差異(P＞0.05);同一性別內試驗組和對照組之間比較有顯著差異(P＜0.01)。

3 討論

CD28分子最早是在PMA刺激活化的T細胞上發(fā)現(xiàn)的，人與小鼠CD28分子的同源性為68%，CD28分子是一種相對分子量為44 kU的同源二聚體糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員，可表達在95%CD4+T細胞表面和50%CD8+T細胞上〔1〕。CD28分子由胞外Ig的V樣區(qū)、穿膜功能區(qū)和胞漿功能區(qū)組成〔2〕，它即可以膜型形式表達在T細胞表面，也可以可溶形式存在于血液中，研究表明，mCD28在老年人T細胞上的表達呈增齡性減少〔3～5〕，而sCD28的含量在老齡人血清中較年輕人明顯升高〔6〕。有試驗證實:sCD28重組蛋白能抑制CD3單抗或絲裂原誘導的T細胞活化〔7〕，抑制細胞的增殖、分化及發(fā)揮免疫效應，對T細胞的應答產(chǎn)生負調節(jié)作用〔6〕。

乳酸桿菌作為一種益生菌，在生物拮抗、抗腫瘤、抗衰老、免疫調節(jié)等方面都有一定的作用。本研究中老齡鼠外周血T細胞mCD28的陽性表達率試驗組高于對照組，并且老齡鼠血清中T細胞sCD28的含量試驗組低于對照組，但同一組內，雄性與雌性小鼠的外周血T細胞mCD28和血清中T細胞sCD28的含量均沒有差異。研究表明:乳酸桿菌可影響T細胞增殖、分化和產(chǎn)生細胞因子的功能，乳酸桿菌還可提高T細胞針對有絲分裂原的增殖能力，使T細胞數(shù)量增多〔8〕。CD28/CTLA4-B7作為T細胞活化的第二信號在T細胞的免疫應答過程中起到關鍵的作用。在小鼠模型中，TCR信號與CD28/CTLA4-B7共刺激信號協(xié)同能引起多種細胞銀子轉錄和翻譯的上調、T細胞增殖等效應，同時證實CD28/CTLA4-B7在自身免疫、腫瘤免疫和移植排斥反應及老化均起重要作用〔1〕。因此，我們有理由推斷:乳酸桿菌的細胞免疫調節(jié)作用與CD28分子水平密切相關，相信在不久的將來乳酸桿菌的免疫調節(jié)機制將會得到進一步的闡述，其作為一種免疫調節(jié)劑具有良好的應用前景。

1 郝秀麗，張逢春.CD28分子的研究進展〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2004;5(2):133-4.

2 錢 峰，吳俊英，李柏青.CD28協(xié)調刺激信號傳導的研究進展〔J〕.國外醫(yī)學·分子生物學分冊，2002;24(5):273.

3 Kozono Y，Abe R，Kozono H，et al.Cross-linking CD21/CD35 or CD19 increases both B7-1 and B7-2 expression on murine splenic B cells〔J〕.J Immunol，1998;160(5):1565-77.

4 Merino J，Martinez MA，Rubio M，et al.Progressive decrease of CD8 high+CD28+CD57-cells with aging〔J〕.Clin Exp Immunol，1998;112(1):48-60.

5 Boucher N，Dufreu-Duchesne T，Vicaut E，et al.CD28 expression in T cells aging and human longevity〔J〕.Exp Gerontol，1998;33(2):267-78.

6 石云杰，顧國潔，史進方.老年人T細胞膜型CD28及血清中可溶性CD28的表達及其意義〔J〕.現(xiàn)代免疫學，2007;27(1):38-40.

7 Maria ST，Thomas LL，F(xiàn)lorentine M，et al.Lake of antibody practioner following immunization in old age:association with CD8+CD28－T cell clonal expansions and an imbalance in the prauction of Thl and Th2〔J〕.J Immunol，2002;169(6):5893-901.

8 Lim BK，Mahendran R，Lee YK，et al.Chemopreventive effect of Lactobacillus rhamnosus on growth of a subcutaneously implanted bladder cancer cell line in the mouse〔J〕.Jpn J Cancer Res，2002;93(1):36-41.