哨兵動物概述

李雨函，魏 強

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物檢測中心，北京 100021）

實驗動物哨兵動物是用于監(jiān)控實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境中病原及病原感染的動物。除特殊監(jiān)測需要之外，哨兵動物一般來源于與被監(jiān)測動物遺傳背景相同的無菌或 SPF級動物。此外，根據(jù)監(jiān)測方式、目標病原的不同需要選擇不同性別和年齡的哨兵動物。哨兵動物的設(shè)置方式和數(shù)量根據(jù)動物飼養(yǎng)環(huán)境和飼養(yǎng)數(shù)量不同而有所區(qū)別，監(jiān)測過程中哨兵動物與被監(jiān)測動物之間的接觸方式主要分為間接接觸和直接接觸。使用哨兵動物需要遵從兩個要點，一是要保證足夠檢測數(shù)量的同時使用最少量的哨兵動物，二是在整個監(jiān)測過程中要使哨兵動物最大限度的暴露于潛在的病原感染環(huán)境中。為監(jiān)測動物群中病原微生物，必須對哨兵動物定期進行檢測。由于使用少量哨兵動物能夠敏感、有效的反映整個實驗動物群的病原微生物狀態(tài)，因此，是一種非常高效的動物健康監(jiān)測方式。

1 哨兵動物定義和適用性

實驗動物學(xué)中所指的哨兵動物來源于實驗動物，但使用目的不是用于動物實驗，而是為了監(jiān)測實驗動物群中病原微生物。也就是說哨兵動物是被特意放置在一定條件下或被飼養(yǎng)在特定位置，而這些位置最有可能是病原傳染的區(qū)域，使哨兵動物感染疾病的機率增加。哨兵動物作為檢測樣本，反映群體中病原傳播，當(dāng)沒有足夠動物（如：僅有少量動物且全部用于實驗）用來做檢測時或同一個飼養(yǎng)單元中沒有合適的動物用于做檢測（如：免疫缺陷動物的血清學(xué)檢測會導(dǎo)致漏檢）的情況下，哨兵動物是最適用的監(jiān)測方法［1，2］。

由于哨兵動物的設(shè)置和管理沒有統(tǒng)一的國際標準或者法規(guī)，不同地區(qū)的實驗動物學(xué)會對該區(qū)域內(nèi)的哨兵動物使用有一些建議和參考，具體的設(shè)置和管理要根據(jù)不同的目的而有所不同。因此，哨兵動物的選用依實驗而定。

2 哨兵動物的選擇

2.1 基本原則

由于沒有統(tǒng)一施行的國際標準，并且哨兵動物的使用和設(shè)置需根據(jù)實驗而定，因此對哨兵動物的選擇會不同，但應(yīng)遵循以下要素：①必須無菌或不攜帶有待監(jiān)測的特定病原以及抗體。②如果哨兵動物和被監(jiān)測動物來自不同的繁殖群，則需要選擇已知微生物狀態(tài)的動物作為哨兵動物。③盡可能與被監(jiān)測動物群的品系相同，但根據(jù)監(jiān)測目的的不同，可選擇不同品系的哨兵動物。④免疫反應(yīng)正常的適齡動物。適齡動物必須能反映出被監(jiān)測動物的健康狀況［3］，一般選用4～8周齡的鼠［1，2］。

2.2 遺傳背景

因非近交系動物容易繁殖、成活率高，因而相對便宜，通常情況下用非近交系動物做哨兵動物。雖然他們對大多數(shù)病原較敏感，但有的動物發(fā)病時的臨床癥狀并不明顯。近交系動物（如 DBA/2，BALB/c）相對雜交動物較難繁殖且成本較高，不同品系之間對疾病的易感性和臨床表現(xiàn)有較大的區(qū)別。例如，鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus，MHV）感染的A/J小鼠通常沒有非常明顯的臨床癥狀，但其他品系（如C57BL/6）鼠感染率和死亡率都很高。C57BL/6和其它有抵抗力的品系（如C57BL/10）感染鼠痘病毒（Ectromelia virus）后并不會有明顯癥狀［5］，然而敏感品系（如 A、DAB/2、BALB/c、C3H）感染鼠痘將導(dǎo)致鼠群內(nèi)高達80％～90％的感染率和死亡率［4，5］。另外，由于近交系動物和轉(zhuǎn)基因動物對某些病原易感，所以適用于特殊情況下的病原監(jiān)測。

2.3 其他

因免疫缺陷動物更容易被感染，所以在使用中應(yīng)特別注意對飼養(yǎng)環(huán)境中微生物和其他污染物的控制。免疫缺陷動物不能通過血清學(xué)檢測它們是否被感染，但是對病原持續(xù)性感染有利于病原的分離。若需使用免疫缺陷動物作為哨兵動物，最好將免疫缺陷動物（胸腺發(fā)育不完全的 Foxn1nu小鼠和Whnrnu大鼠，B 細胞和 T細胞缺乏的 Prkdcscid或Ragtm1Mom小鼠）和免疫系統(tǒng)正常的動物放在相同飼養(yǎng)單元內(nèi)飼養(yǎng)（最好是有毛雜合體和裸鼠一起飼養(yǎng)）［1］。

此外，哨兵動物進場之前必須隔離觀察和檢測，這些都有助于減少經(jīng)哨兵動物傳入的病原，這對免疫缺陷動物尤其重要。為減少動物間的打斗，尤其是雄性動物為爭奪資源的打斗行為，接觸式哨兵動物一般選用雌性動物較容易與被監(jiān)測動物群相容［2］。

3 哨兵動物的應(yīng)用

3.1 使用方式

哨兵動物與被監(jiān)測動物的接觸方式分為間接接觸和直接接觸。

3.1.1 間接接觸：常用于監(jiān)測經(jīng)排泄物傳播的疾病，被監(jiān)測動物數(shù)量較多，也用于監(jiān)測設(shè)備或運輸材料是否帶有病原。間接接觸法中最常用的是舊墊料法，即每次換墊料時將被監(jiān)測籠盒內(nèi)取出約2盎司（約50 g）墊料放入哨兵動物籠盒內(nèi)，或使用100％舊墊料［7］。為了保證有足量的墊料滿足動物筑巢行為，也可加入一些新的墊料，但至少要保證50％的墊料是舊墊料。建議一個小鼠哨兵籠每次接受12～20個的被監(jiān)測籠的墊料，；大鼠和倉鼠每次最多接受來自10個被監(jiān)測籠的墊料［6］。4～10周后，該批次哨兵動物被送至檢測部門進行檢測。如果飼養(yǎng)設(shè)施可以將收集的廢氣通入哨兵籠盒內(nèi)，也可利用廢氣法監(jiān)測經(jīng)呼吸道傳播的病原。因此，對哨兵動物同時用舊墊料和廢氣可以有效增加 IVC系統(tǒng)中的微生物監(jiān)測效率。

3.1.2 直接接觸：即將哨兵動物直接放入被監(jiān)測動物群中，可監(jiān)測小范圍內(nèi)的經(jīng)氣溶膠或排泄物，分泌物傳播的疾病，這種方法可檢測到間接接觸法不能檢測到的病原，被監(jiān)測動物數(shù)量較少［2］。雖然該法是病原更容易傳播的方法未得到證實，但該法可以有效的檢出一些經(jīng)氣溶膠和排泄、分泌物傳播的病原［3，8］，最適合用于小群體的健康監(jiān)測，也適用于一些經(jīng)由籠具或交叉感染引起的傳染?。?］。但在實際操作中，應(yīng)注意由于新個體的介入可能引起被監(jiān)測動物與哨兵動物打斗或者雄性動物選擇哨兵動物作為配偶等行為［9］。

3.2 監(jiān)測范圍和設(shè)置方法

3.2.1 入場前監(jiān)測：對新到的即將進場的動物必須進行檢測和監(jiān)測。未進場之前建議飼養(yǎng)在生物安全級別2級的負壓環(huán)境中。操作人員必須按照生物安全二級實驗室要求穿戴工作服。動物到達的72 h內(nèi)采集血、皮膚、糞便樣本進行檢測。在動物群中放入接觸式哨兵動物，18 d后取出哨兵動物進行檢測。檢測結(jié)果符合要求后動物才能進場飼養(yǎng)［2］。在之后的飼養(yǎng)階段中可以使用間接接觸式哨兵動物。

3.2.2 入場后監(jiān)測：在使用開架飼養(yǎng)和層流柜飼養(yǎng)小鼠時，應(yīng)在飼養(yǎng)架底層每側(cè)放置一個哨兵籠盒，用舊墊料法最多可以監(jiān)測34個籠位。飼養(yǎng)架上少于35個籠子的需要在飼養(yǎng)架進口處放置一個哨兵籠。在飼養(yǎng)大鼠和地鼠架的底層每側(cè)放置一個哨兵籠，最多可以監(jiān)測24～30個籠子［10］。其它嚙齒動物哨兵籠設(shè)置要根據(jù)需要而定。

IVC系統(tǒng)中根據(jù)飼養(yǎng)方式、條件和要求的不同，每個哨兵籠監(jiān)測的范圍也不同。整個系統(tǒng)中飼養(yǎng)的動物都是同一品系、相同健康標準（如生產(chǎn)繁殖群）、且生產(chǎn)成本并不高的動物群時，可采用隨機抽檢的方法。但因為每一個被抽檢到的籠盒只能代表其相近區(qū)域，要求均勻抽檢。

當(dāng)系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)的動物比較珍貴但沒有足夠的剖檢資源；或同一系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)的動物健康要求相同、但籠與籠之間品系不同，舊墊料法或者廢氣法監(jiān)測都很適用。若要求較高，可以同時用舊墊料加上廢氣法更加嚴格的控制動物質(zhì)量［11］。在廢氣出口處順其流動方向依次設(shè)置僅接受廢氣的哨兵動物籠，僅接受舊墊料的哨兵動物籠、及接受廢氣又接受舊墊料的哨兵動物籠［11］。

每個籠內(nèi)飼養(yǎng)4只哨兵動物，若實驗沒有特殊要求，一批哨兵動物使用不超過12周［10，11］。在第6周時取兩只哨兵動物進行剖檢，可以檢測前6周微生物狀態(tài)。同時在哨兵籠中加入兩只新的哨兵鼠以便檢測后6周微生物狀態(tài)。在12周結(jié)束后將哨兵籠中的4只哨兵鼠全部進行剖檢［11］，后加入的兩只哨兵動物可以反映出后六周的微生物污染狀況，另外2只可反映出1～12周的微生物狀態(tài)。

3.2.3 運輸和設(shè)施監(jiān)測：為使運輸過程中污染風(fēng)險降低到最小，用哨兵動物監(jiān)測整個運輸過程是保證動物質(zhì)量的一個有利方法［9］。在運輸設(shè)備使用前后，將哨兵動物飼養(yǎng)其中，4周后用血清學(xué)檢測哨兵動物是否有感染。運輸途中由于空氣對動物質(zhì)量影響較大，哨兵動物要和被監(jiān)測動物飼養(yǎng)在同樣的籠子和環(huán)境中（如被監(jiān)測群體的籠具有過濾蓋，那么哨兵動物的籠具也要有過濾蓋）［9］，運抵目的地后隔離檢疫，沒有可疑狀況再轉(zhuǎn)入正常飼養(yǎng)環(huán)境［10］。

在用哨兵動物對環(huán)境設(shè)施進行監(jiān)測時，根據(jù)檢測目的的不同來設(shè)置哨兵動物。若被監(jiān)測設(shè)施有氣流和氣壓的設(shè)置，要求在氣流進氣口處和排氣口處都放置哨兵動物進行監(jiān)測［6，9］。

3.3 檢測數(shù)量

哨兵動物檢測數(shù)量根據(jù)被監(jiān)測動物數(shù)量和待監(jiān)測微生物特性以及實驗計劃而設(shè)定。取樣通常以飼養(yǎng)單元為基礎(chǔ)。一個飼養(yǎng)單元是指由同一個人（動物飼養(yǎng)員或研究人員）管理的、衛(wèi)生標準相同的特定動物飼養(yǎng)區(qū)。為使檢測樣本在一定置信區(qū)間內(nèi)能代表整個群體的狀況，被檢動物的數(shù)量要能適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)出動物群中的感染率。FELASA推薦的公式，但僅適用于群體數(shù)大于100只，感染隨機分布于群體中，被檢樣本是隨機采樣，傳染不受性別年齡影響［3］。按照FELASA推薦的計算公式，期望檢出的感染率為 30％，置信度分別為 95％、99％、99.9％時，所需樣本量分別為10只、13只和20只動物，在這些待檢動物中至少有一只檢出為陽性。

3.4 檢測頻率

檢測頻率是至少每季度檢測一次，也需要根據(jù)當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境和研究需要增加檢測的頻率。發(fā)病和死亡的動物必須剖檢，這是在常規(guī)檢測之外必須要做的，剖檢結(jié)果將指導(dǎo)是否要增加檢測頻率或者增加被檢動物的數(shù)量。由于一些病原的宿主特異性還并不完全明了，有的飼養(yǎng)單元中不止飼養(yǎng)一種動物，根據(jù)檢測日程，每種動物要分開檢測。同理，如果不同的品系對病原的血清學(xué)反應(yīng)不同也要分開檢測。如果相同飼養(yǎng)單元內(nèi)飼養(yǎng)多個品系就需要至少每年對品系進行一次檢測。檢測的樣本大小主要取決于被監(jiān)測動物總數(shù)的多少、最終要檢出的感染率和檢測周期。如果病原感染的機率較高，檢測的頻率也要隨之增多。

4 總結(jié)

設(shè)置有效地監(jiān)測項目是保證實驗動物質(zhì)量的重要保障。設(shè)計一個有效地檢測項目要求將目標置信度，被監(jiān)測實驗動物數(shù)量、監(jiān)測時段，以及為達到質(zhì)量保障要求所必須的飼養(yǎng)環(huán)境都應(yīng)考慮周全。雖然質(zhì)量監(jiān)測項目需花費經(jīng)費和時間，但這樣的成本比發(fā)生疫情后導(dǎo)致?lián)p失或重建動物種群的支出要少。根據(jù)監(jiān)測目標來確定項目的花費、監(jiān)測的有效時間和統(tǒng)計學(xué)意義都應(yīng)體現(xiàn)在監(jiān)測項目的設(shè)計中，以確定操作和統(tǒng)計數(shù)據(jù)的有效性。由于監(jiān)測項目的可行性是建立在統(tǒng)計學(xué)上的，所以當(dāng)檢測項目設(shè)立的假設(shè)條件難以滿足時也會有監(jiān)測失敗。通過增加被檢動物數(shù)量等適當(dāng)?shù)难a充方法和限制措施來減少檢測項目失敗的概率也是有必要的。

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