Toll樣受體4：神經(jīng)病理性疼痛潛在的治療靶標

賈澤軍，吳飛翔，黃清海，劉建民

1第二軍醫(yī)大學(xué) 長海醫(yī)院臨床神經(jīng)醫(yī)學(xué)中心 神經(jīng)外科，上海 2004332第二軍醫(yī)大學(xué) 科研部學(xué)報編輯部，上海 2004333第二軍醫(yī)大學(xué) 東方肝膽外科醫(yī)院麻醉科，上海 200438

·綜述·

Toll樣受體4：神經(jīng)病理性疼痛潛在的治療靶標

賈澤軍1，2，吳飛翔3，黃清海1，劉建民1

1第二軍醫(yī)大學(xué) 長海醫(yī)院臨床神經(jīng)醫(yī)學(xué)中心 神經(jīng)外科，上海 200433
2第二軍醫(yī)大學(xué) 科研部學(xué)報編輯部，上海 200433
3第二軍醫(yī)大學(xué) 東方肝膽外科醫(yī)院麻醉科，上海 200438

神經(jīng)膠質(zhì)細胞激活在神經(jīng)病理性疼痛(NP)發(fā)生和維持中發(fā)揮重要作用。Toll樣受體4(TLR4)通過激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細胞(主要是小膠質(zhì)細胞)，誘導(dǎo)促炎因子、神經(jīng)活性物質(zhì)等的釋放，參與NP的形成和維持及阿片類藥物的不良反應(yīng)，已成為潛在的NP治療靶標。靶向抑制TLR4的生物學(xué)效應(yīng)在NP模型中已取得初步療效，其中TLR4信號通路抑制劑—異丁司特已進入Ⅱ期臨床試驗。本文主要綜述TLR4的結(jié)構(gòu)、功能、作用機制、靶向藥物研發(fā)現(xiàn)狀等。

神經(jīng)病理性疼痛；Toll樣受體4；小膠質(zhì)細胞；靶向治療

ActaAcadMedSin,2012,34(2):168-173

神經(jīng)病理性疼痛是指由外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)異?；蚬δ軗p傷及炎癥病變導(dǎo)致的難以緩解的慢性疼痛，又稱神經(jīng)源性疼痛或神經(jīng)痛。其臨床特征主要表現(xiàn)為：自發(fā)性疼痛、痛覺過敏(hyperalgesia)、痛覺超敏(allodynia)[1]。臨床常見的三叉神經(jīng)痛、糖尿病神經(jīng)痛、帶狀皰疹性疼痛、截肢后幻肢痛等涉及神經(jīng)病理性疼痛[2-4]。目前常用的強效麻醉性鎮(zhèn)痛藥對其治療效果有限，且長期用藥不良反應(yīng)較多，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[3-4]，是近年來麻醉鎮(zhèn)痛研究的熱點。神經(jīng)病理性疼痛的病因及發(fā)病機制目前尚不明確，以往研究一直集中于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)痛覺傳導(dǎo)通路敏化；近年研究顯示炎癥反應(yīng)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞激活、神經(jīng)膠質(zhì)-神經(jīng)免疫機制及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等可能在其中發(fā)揮重要作用[2,5]。

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)家族是天然免疫受體之一，是一種模式識別受體，可識別存在于病原體細胞表面的病原相關(guān)分子標志，在機體天然及獲得性免疫、炎癥反應(yīng)、自身免疫等過程中發(fā)揮重要作用[6-7]。目前在哺乳動物體內(nèi)共鑒定出13個TLR家族成員(TLR 1～13)，人類有10個(TLR 1～10)[5]。其中，TLR4是首個被鑒定出來的TLR家族成員，廣泛表達于機體各個系統(tǒng)，參與機體重要的免疫防御，也存在于嚙齒類動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)，但主要特異性表達于小膠質(zhì)細胞[2]。近年來，大量研究表明TLR4可通過激活小膠質(zhì)細胞，激活下游信號通路，引發(fā)一系列炎癥因子的表達，調(diào)制神經(jīng)免疫，最終誘發(fā)神經(jīng)病理性疼痛，可能是神經(jīng)病理性疼痛潛在的治療靶標[2,5,8]。因此，本文就TLR4與神經(jīng)病理性疼痛的最新研究進展作一綜述。

TLR4的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能

TLR4的結(jié)構(gòu)特征與TLR家族其他成員一樣，TLR4也屬于Ⅰ型跨膜受體蛋白，由胞外段、跨膜區(qū)、胞內(nèi)段共3個功能區(qū)組成，其胞外段富含24個亮氨酸重復(fù)序列，通過β折疊、環(huán)-α螺旋等形成馬蹄形結(jié)構(gòu)，參與識別各種病原體，引起免疫反應(yīng)。其胞內(nèi)區(qū)含有大約200 個氨基酸殘基，由Toll/白細胞介素(interleukin,IL)-1受體同源結(jié)構(gòu)域(Toll/IL-1 receptor homologous region, TIR)和羧基端長短不同的短尾肽(0～22個氨基酸)組成。TIR屬保守結(jié)構(gòu)，是受體活化后下游信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本元件[8]。

TLR4的主要生物學(xué)功能TLR4基因定位于9q32-33，組織分布廣泛，以同源二聚體形式表達于免疫細胞和非免疫細胞，如小膠質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞、單核細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞、小腸上皮細胞、人齒齦纖維母細胞、人子宮頸平滑肌細胞、呼吸上皮細胞、大鼠脾和心肌細胞等，是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)應(yīng)答的主要受體。TLR4的生物學(xué)作用較復(fù)雜，包括(1)介導(dǎo)天然免疫：TLR4表達于天然免疫細胞，是LPS應(yīng)答的主要受體，識別LPS，激活天然免疫細胞，誘導(dǎo)機體天然免疫應(yīng)答；(2)介導(dǎo)天然免疫向獲得性免疫的過渡：TLR4不僅在天然免疫中發(fā)揮重要作用，在獲得性免疫中也有重要意義，TLR4可通過LPS活化樹突狀細胞，使后者表達一系列處理和抗原提呈所必須的表面分子，激活獲得性免疫；(3)促發(fā)炎癥反應(yīng)：TLR4被入侵病原體刺激后，激活TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，活化核因子-κB，啟動核內(nèi)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄與表達，誘導(dǎo)一系列炎癥因子[ILs、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、γ干擾素等]分泌和表達，促發(fā)炎癥反應(yīng)；(4)參與免疫耐受：TLR4缺陷個體由于缺乏TLR4功能，后續(xù)信號無法下傳，表現(xiàn)為對LPS低反應(yīng)性，甚至免疫耐受[9-10]。

TLR4相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

TLR4完成上述所有功能離不開外源病原體刺激、相關(guān)分子的協(xié)同，更依賴于TLR4強大的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。TLR4參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有如下幾種：(1)MyD88依賴信號通路：TLR4識別LPS后與MD-2結(jié)合發(fā)生構(gòu)象改變，與下游的MyD88結(jié)合，進而激活TIRAP/MAL等分子，最終激活核因子-κB，介導(dǎo)天然免疫；(2)MyD88非依賴信號通路：TLR4活化后通過TRAM-TRIF激活下游信號，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)；(3)其他：TLR4下游信號通路還包括PI3K、p38MAPK、JNK等信號通路，均發(fā)揮重要生理作用[10-11]。

TLR4介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛的可能機制

TLR4介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛的效應(yīng)細胞及分子

小膠質(zhì)細胞、星型膠質(zhì)細胞的激活：近年研究顯示，神經(jīng)膠質(zhì)細胞具有免疫細胞的屬性，其中的小膠質(zhì)細胞、星型膠質(zhì)細胞發(fā)揮著類似免疫系統(tǒng)抗原提呈細胞的作用[12-13]。小膠質(zhì)細胞可被損傷、病毒、細菌等激活。激活的小膠質(zhì)細胞類似巨噬細胞，具有吞噬功能，并釋放神經(jīng)活性物質(zhì)(P物質(zhì)、興奮性氨基酸、一氧化氮)、促炎癥因子，對抗損傷、清除病原體。這一過程本身有利于機體對抗病原入侵，但也會帶來不良反應(yīng)，產(chǎn)生神經(jīng)病理性疼痛。

膠質(zhì)細胞激活產(chǎn)生神經(jīng)病理性疼痛的路徑較多，其中TLR4可能發(fā)揮重要作用。Tanga 等[14]在L5神經(jīng)損傷雄性大鼠模型中發(fā)現(xiàn)脊髓膠質(zhì)細胞TLR4高表達與神經(jīng)損傷后痛覺超敏密切相關(guān)；他們進一步研究顯示，L5神經(jīng)切斷后TLR4基因敲除及TLR4基因突變小鼠熱痛閾、機械痛閾明顯高于野生小鼠；對雄性L5神經(jīng)切斷大鼠鞘內(nèi)注射TLR4抑制性寡核苷酸可降低脊髓膠質(zhì)細胞激活相關(guān)標志及促炎因子的表達，明顯減輕大鼠對痛覺的敏感性，首次在小鼠及大鼠模型證實TLR4在膠質(zhì)細胞激活中的作用[2]，為臨床神經(jīng)病理性疼痛的診治提供了新靶點。

目前研究證實，激活的小膠質(zhì)細胞主要通過釋放神經(jīng)活性物質(zhì)、促炎因子等途徑在神經(jīng)病理性疼痛的形成和維持中發(fā)揮重要作用，而星型膠質(zhì)細胞則發(fā)揮協(xié)同作用[5,15]。越來越多的證據(jù)表明，TLR4信號通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)小膠質(zhì)細胞激活過程中發(fā)揮重要作用。TLR4特異表達于腦和脊髓小膠質(zhì)細胞表面，當(dāng)接受LPS或內(nèi)源性傷害性刺激后可特異性激活小膠質(zhì)細胞，引起p38MAPK、JNK等信號通路的激活，促使核因子-κB進入細胞核，誘導(dǎo)mRNA的轉(zhuǎn)錄及表達，促進一系列促炎因子及神經(jīng)活性物質(zhì)的分泌及釋放，最終導(dǎo)致神經(jīng)痛的形成[2,14,16-17]。

促炎癥因子的放大效應(yīng)：LPS或機體內(nèi)源性損傷因子促進TLR4表達增多，引起CNS局部小膠質(zhì)細胞及機體其他免疫細胞分泌大量的促炎因子，包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10等。這些促炎因子的釋放導(dǎo)致更多的免疫細胞釋放大量的炎癥因子，活化或敏化痛覺纖維，產(chǎn)生痛覺過敏或超敏[18-20]。

研究表明，多個神經(jīng)病理性疼痛動物模型中存在IL-1β的高表達，采用特異性抑制劑阻止其表達可減輕動物的神經(jīng)病理性疼痛。IL-1β可能通過促進痛覺易化及神經(jīng)活性物質(zhì)釋放誘導(dǎo)痛覺過敏[21]。TNF-α可活化腦及脊髓小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞分化，募集炎癥細胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生痛覺過敏。阻斷TNF-α信號通路可明顯緩解動物的神經(jīng)病理性疼痛[22]。膠質(zhì)細胞本身也表達促炎因子受體，與這些因子結(jié)合后，進一步促進促炎因子的表達。如星型膠質(zhì)細胞表面表達IL-1受體，與IL-1結(jié)合后，誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6，直接興奮痛覺神經(jīng)元，誘導(dǎo)神經(jīng)出芽，增強機械痛敏、熱痛敏[21-22]。

促炎因子之間具有協(xié)同作用，可聯(lián)合產(chǎn)生級聯(lián)效應(yīng)；促炎癥因子的分泌大多是旁分泌，可經(jīng)過細胞外液作用于其他細胞，不再局限于單個細胞；促炎癥因子可通過膠質(zhì)細胞的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活化遠處的膠質(zhì)細胞。因此，TLR4的表達增加可通過促進促炎因子的分泌強化促炎作用，在神經(jīng)病理性疼痛的維持中發(fā)揮重要作用。TLR4促進膠質(zhì)細胞合成促炎因子可能與p38MAPK信號通路有關(guān)。應(yīng)用p38MAPK信號抑制劑可部分阻斷促炎因子的合成，明顯緩解神經(jīng)病理性疼痛[23]。

TLR4發(fā)揮作用依賴的分子隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)單純TLR4表達增高并不能完全誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛，還必須依賴一系列分子的參與。Hutchinson等[24]研究顯示鞘內(nèi)注射LPS促進TLR4表達并未增強正常大鼠痛覺敏感性，進一步體外細胞信號分析及體內(nèi)疼痛實驗結(jié)果表明，HSP90在TLR4誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮重要作用，TLR4受體復(fù)合物整體是神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生基礎(chǔ)。Cao等[25]研究顯示，CD14基因敲除小鼠L5截斷后熱痛閾、機械痛閾明顯增高；小鼠L5截斷后3 d，細胞表面CD14表達明顯增多；鞘內(nèi)注射游離性CD14可明顯提高小鼠的機械痛敏。結(jié)果表明，CD14在TLR4誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛中亦發(fā)揮重要作用。其他的如MD-2、膽囊收縮素B2等分子也發(fā)揮重要作用[26-27]。此外，部分實驗采用基因突變的方法研究發(fā)現(xiàn)，超氧化物歧化酶、蛋白酪氨酸磷酸酶-1等分子可能有利于抑制TLR4誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛，產(chǎn)生保護性作用[28-29]。這提示TLR4的作用可能還受到一系列其他因子的影響，需要進一步深入研究。

TLR4與阿片類藥物耐受、依賴及戒斷癥狀阿片類藥物是常用的高效鎮(zhèn)痛劑，但長期應(yīng)用會導(dǎo)致藥物耐受、藥物依賴等不良反應(yīng)，一旦停用會出現(xiàn)戒斷癥狀，嚴重制約了其臨床應(yīng)用。有研究顯示阿片類藥物的不良反應(yīng)與膠質(zhì)細胞激活有關(guān)，TLR4在其中發(fā)揮了重要作用[30-31]。阿片類藥物可非立體選擇性作用于TLR4，激活膠質(zhì)細胞，拮抗其鎮(zhèn)痛作用，引起一系列不良作用，靶向TLR4或p38MAPK的藥物可抑制阿片類藥物耐受、依賴等不良反應(yīng)，增強其鎮(zhèn)痛療效，減少藥物用量[30-31]。阿片類受體拮抗劑，如納洛酮、納曲酮等，也可非立體選擇性抑制TLR4，進而抑制膠質(zhì)細胞活化，緩解神經(jīng)損傷后神經(jīng)病理性疼痛[17]。這也互相印證了TLR4與阿片類藥物作用機制的相關(guān)性。

性別對TLR4介導(dǎo)效應(yīng)的影響TLR4介導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛在不同性別的動物產(chǎn)生不同的效果，引起了人們的重視。Sorge等[32]研究顯示，注射LPS促進脊髓TLR4表達僅能誘導(dǎo)雄性小鼠產(chǎn)生痛覺過敏、炎癥反應(yīng)，而對雌性小鼠不產(chǎn)生明顯作用，但兩者TLR4的表達無明顯差異；如腦內(nèi)注射LPS，效果就無性別特異性。結(jié)果提示，LPS介導(dǎo)的雄性小鼠脊髓神經(jīng)病理性疼痛可能與睪酮激素相關(guān)，雌性小鼠脊髓神經(jīng)病理性疼痛可能與TLR4無關(guān)。這一現(xiàn)象可能在大鼠也存在。Tanga等[2,14]的系列研究以及吳飛翔等[33]在采用坐骨神經(jīng)結(jié)扎模型時均選擇雄性大鼠而不是雌性大鼠。

TLR4與其他TLR的聯(lián)合作用TLRs家族成員間存在相互作用，TLR4也不例外。研究表明，TLR3可能通過激活脊髓小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛，鞘內(nèi)注射TLR3抑制劑可部分緩解神經(jīng)痛，其作用機制部分與TLR4有交叉。Mei等[34]研究顯示，TLR3可介導(dǎo)神經(jīng)損傷后的脊髓神經(jīng)病理性疼痛，此作用可被氯胺酮部分緩解。但Qian等[35]研究認為，TLR3在胰腺炎所導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮主要作用，與TLR2、TLR4作用不大。此外，Guerrero等[36]研究顯示，TLR2與TLR4在介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛中有一定的聯(lián)系，值得深入研究。

靶向TLR4藥物研發(fā)現(xiàn)狀

靶向TLR4藥物治療的動物實驗鑒于TLR4在神經(jīng)病理性疼痛中的重要作用，人們采用了一系列靶向抑制TLR4通路的手段觀察其對神經(jīng)病理性疼痛的影響，取得初步進展。Wu等[37]鞘內(nèi)注射TLR4-siRNA可明顯降低神經(jīng)損傷所導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛大鼠的痛敏；Bettoni等[16]腹腔注射自制的TLR4抑制劑可明顯緩解神經(jīng)損傷小鼠的神經(jīng)痛；鞘內(nèi)注射p38MAPK抑制劑或促炎因子拮抗劑可明顯緩解TLR4介導(dǎo)的神經(jīng)損傷后病理性疼痛。Lan等[38]采用RNAi技術(shù)抑制TLR4表達，可明顯減輕骨癌模型大鼠的神經(jīng)病理性疼痛，取得一定效果；Liu等[23]鞘內(nèi)注射p38MAPK抑制劑(SB203580)和TLR4-siRNA均能抑制脛骨腫瘤誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛。由于TLR4在阿片類藥物耐受、依賴等不良反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，Hutchinson等[30-31]采用動物實驗，直接阻斷TLR4、TLR4敲除、抑制TLR4信號下游分子等措施明顯延長了阿片類藥物的鎮(zhèn)痛效果。

此外，一些免疫炎癥性疾病的靶向TLR4藥物治療實驗也在逐步開展。Christianson等[39]研究顯示，TLR4在急性血清轉(zhuǎn)移性關(guān)節(jié)炎疼痛向慢性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用，靶向TLR4的治療可能會延緩此過程。

靶向TLR4藥物治療的臨床試驗美國FDA近年批準了2個靶向膠質(zhì)細胞激活治療神經(jīng)病理性疼痛的藥物用于Ⅱ期臨床試驗，分別是異丁司特和丙戊茶堿，其中前者被允許進行阿片類藥物臨床增效測試，二者均可口服用藥，易于透過血腦屏障，均能在不同神經(jīng)病理性疼痛模型中抑制膠質(zhì)細胞激活，但作用機制并不相同[40-42]。異丁司特可拮抗白三烯和血小板活化因子，以往被用于治療支氣管哮喘、腦動脈硬化。丙戊茶堿是神經(jīng)保護藥，目前在進行治療阿爾茨海默癥的Ⅲ期臨床試驗，可能對癡呆有一定的療效。最新研究顯示，異丁司特是TLR4信號通路抑制劑，可抑制促炎因子的產(chǎn)生，拮抗炎癥因子，發(fā)揮抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞活化的作用，最終緩解或抑制神經(jīng)病理性疼痛及提高阿片類藥物的作用效果[40]。

綜上，CNS神經(jīng)膠質(zhì)細胞(主要是小膠質(zhì)細胞和星型膠質(zhì)細胞)激活在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和維持中發(fā)揮重要作用的觀點得到廣泛認可，而TLR4在此過程中發(fā)揮重要的調(diào)制作用。TLR4主要通過激活CNS小膠質(zhì)細胞，促進神經(jīng)活性物質(zhì)、促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10)等的表達，誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持，參與阿片類藥物的耐受、依賴及戒斷癥狀。單獨的TLR4無法發(fā)揮作用，必須與CD14、MD2、HSP90等一系列小分子組成復(fù)合物，通過一系列下游信號通路(p38MAPK、PI3K等)發(fā)揮作用。靶向抑制TLR4信號通路的藥物可以阻斷信號下傳，緩解神經(jīng)病理性疼痛，在神經(jīng)損傷痛、腫瘤痛、炎癥痛等模型中均取得初步療效。但是，TLR4信號通路并不是唯一的小膠質(zhì)細胞激活途徑，其確切作用機制在腦和脊髓存在較大差異。

(志謝：本文形成過程中得到第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部神經(jīng)生物學(xué)教研室由振東教授及第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院神經(jīng)外科洪波副教授的支持和幫助，在此一并表示衷心感謝！)

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Toll-likeReceptor4:ThePotentialTherapeuticTargetforNeuropathicPain

JIA Ze-jun1,2, WU Fei-xiang3, HUANG Qing-hai1, LIU Jian-min1

1Department of Neurosurgery, Clinical Neural Medical Center, Changhai Hospital,
Second Military Medical University, Shanghai 200433,China
2Editorial Department ofAcademicJournalofSecondMilitaryMedicalUniversity, Shanghai 200433,China
3Department of Anesthesia, Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital,
Second Military Medical University, Shanghai 200438,China

LIU Jian-min Tel:021-81873451,E-mail: liu118@vip.163.com

Activation of microglia plays a vital role in the initiation and maintenance of specific neuropathic pain states. By activating microglia in central nervous system, Toll-like receptor 4 (TLR4) can promote the release of proinflammatory cytokines and neuroactive compounds, participate in the initiation and maintenance of neuropathic pain, and trigger the opiate side effects. Therefore, TLR4 may be a potential therapeutic target for neuropathic pain. Inhibition of TLR4 has shown some biological effects in neuropathic pain models and ibudilast (the TLR4 pathway-inhibiting agent) has been approved for for phase Ⅱ clinical trials. This article briefly reviews the structure, function, and mechanism of TLR4 as well as the development of TLR4-targeted drugs.

neuropathic pain; Toll-like receptor 4; microglia; target therapy

劉建民 電話：021-81873451，電子郵件: liu118@vip.163.com

R338

A

1000-503X(2012)02-0168-06

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.02.013

國家自然科學(xué)基金(30901403,81101906) Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(30901403,81101906)

2011-12-07)