大蒜汁抑菌作用的研究

雷曉燕

(沈陽化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，遼寧沈陽110142)

大蒜(Allium sativum L.)別名胡蒜，多年生宿根草本植物，可食部分為地下鱗莖，味辛辣［1］.早在4 000多年前人們就已開始食用大蒜，大蒜不僅是調(diào)味品，也是具有天然療效的保健食品，它的藥用價值早在李時珍的《本草綱目》中就有詳細記載.近年來，大蒜因其含有多種營養(yǎng)成分和獨特保健功能備受世人矚目［2］.大蒜不僅富含蛋白質(zhì)、糖類、多種維生素及礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，而且含有有明顯功能作用的大蒜素.大蒜素是大蒜中大蒜辣素、大蒜新素以及多種烯丙醛硫醚等化合物的總稱［3］.大蒜素有促進新陳代謝、降低膽固醇的作用，對高血壓、高血脂、動脈硬化和糖尿病等疾病有一定的療效［4－6］.據(jù)報道大蒜中的活性成分可以進入致病菌的細胞質(zhì)，干擾細胞的正常代謝，從而有對致病菌的抑制和殺滅作用，所以大蒜被人們譽為是天然廣譜抗生素［7－8］.大蒜以無過敏反應(yīng)、無副作用、無毒性等得天獨厚的優(yōu)點，一直被世界各國人民廣泛使用，目前大蒜在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域已受到了高度的重視，各種相關(guān)的系列產(chǎn)品正在不斷地開發(fā)中［9－10］.我國是世界上大蒜產(chǎn)量最高的國家，充足的原料來源使我們有優(yōu)越的條件對大蒜及其系列產(chǎn)品進行深度開發(fā).本實驗旨在為大蒜在人們?nèi)粘Ｉ钪械膽?yīng)用以及在食品工業(yè)中的開發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 實驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)和枯草桿菌(Bacillus subtilis)，由沈陽化工大學(xué)微生物實驗室提供.

1.1.2 大蒜

新鮮，無芽，無蟲蛀的白皮馬芽蒜，購自沈陽市鐵西區(qū)九路農(nóng)貿(mào)市場.

1.1.3 培養(yǎng)基

(1)細菌液體培養(yǎng)基:蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%，牛肉膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%，pH值7.2～7.4.

(2)細菌固體培養(yǎng)基:蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%，牛肉膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%，瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%，pH值7.2～7.4.

1.1.4 主要試劑

培養(yǎng)基成分為市售分析純和生化試劑.

1.1.5 主要儀器

DHP-420電熱恒溫培養(yǎng)箱，光明醫(yī)療儀器廠;LDZX-40BⅠ型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠;ZD-85氣浴恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司;WD900微波爐，順德市格藍仕電器實業(yè)有限公司;HNP-1水平流形超凈工作臺，南通滬南科學(xué)儀器有限公司;101-2A型數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱，上海陽光實驗儀器有限公司;FA1104分析天平，上海精科天平有限公司;BC/BD-428A臥式冷藏冷凍轉(zhuǎn)換柜，青島海爾特種電冰柜有限公司;722-2000型分光光度計，山東高密彩虹分析儀器有限公司;HH4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司.

1.2 方法

1.2.1 大蒜汁的制備

取新鮮大蒜，去皮，洗凈并晾干表面水分，在無菌的試驗條件下，用刀片將蒜切成小塊，在研缽中將大蒜研碎至蒜泥狀.將制得的蒜泥用兩層無菌紗布擠壓過濾得到大蒜汁原汁，備用.

1.2.2 試驗菌菌懸液的制備

將試驗菌接種于斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18 h，用接種環(huán)取適量菌體，接種于20 mL液體培養(yǎng)基，37℃水浴震蕩培養(yǎng)18 h.18 h的菌懸液用血球計數(shù)板進行計數(shù)，若計數(shù)結(jié)果顯示菌懸液數(shù)量超過1×109～2×109個/mL，將菌懸液進行梯度稀釋使菌數(shù)量達到1×109～2×109個/mL，備用.

1.2.3 大蒜汁對試驗菌抑菌圈的測定

取含菌量為1×109～2×109個/mL的試驗菌1 mL，加入無菌平皿中.將固體培養(yǎng)基加熱至完全溶化，待晾至適宜溫度，倒入平皿中制成混菌平板.用無菌鑷子在混菌平板表面放兩張直徑2 cm的無菌濾紙片，用微量注射器吸取50 μL大蒜汁滴加在濾紙片上，然后將平皿置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).24 h后觀察濾紙片周圍是否有不長菌的透明抑菌圈，若有抑菌圈測定抑菌圈直徑.

1.2.4 大蒜汁對3種試驗菌最低抑菌濃度的測定

取適量大蒜汁原液，加入等量無菌蒸餾水中，得到體積分?jǐn)?shù)為50%的大蒜汁稀釋液，再依次將大蒜汁稀釋為體積分?jǐn)?shù)為25%、12.5%、6.25%的大蒜汁稀釋液.分別用含菌量為1× 109～2×109個/mL的3種試驗菌菌懸液制成混菌平板，待凝后在混菌平板上放置無菌濾紙片，在濾紙片上分別滴加50 μL體積分?jǐn)?shù)為50%、25%、12.5%和6.25%的大蒜汁，將平皿置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).24 h后觀察并測定抑菌圈直徑.

1.2.5 溫度對大蒜汁抑菌作用的影響

將體積分?jǐn)?shù)為25%的大蒜汁分別裝在5個無菌空瓶中，分別在15℃、35℃、55℃、75℃、95℃恒溫水浴鍋中處理1 h后備用.分別取含菌量為1×109～2×109個/mL金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌各1 mL制成混菌平板.分別測定不同溫度下處理過的體積分?jǐn)?shù)為25%的大蒜汁對3種試驗菌的抑菌作用.

1.2.6 pH值對大蒜汁抑菌作用的影響

將體積分?jǐn)?shù)為25%的大蒜汁的pH值分別調(diào)為3.0、4.0、5.0、6.0和7.0.分別取含菌量為1×109～2×109個/mL金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌各1 mL制成混菌平板.分別測定不同pH值的體積分?jǐn)?shù)為25%的大蒜汁的抑菌作用.

1.2.7 熱處理時間對大蒜汁抑菌作用的影響

將體積分?jǐn)?shù)為25%的大蒜汁分別裝在6個無菌空瓶中，分別在55℃恒溫水浴鍋中處理0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h后，取出備用.分別取含菌量為1×109～2×109個/mL金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌各1 mL制成混菌平板.分別測定不同熱處理時間的體積分?jǐn)?shù)為25%的大蒜汁的抑菌作用.

1.2.8 大蒜汁對試驗菌株生長抑制作用的測定

將試驗菌接種于斜面培養(yǎng)基活化后，用接種環(huán)取適量菌體，接種于20 mL液體培養(yǎng)基，37℃水浴震蕩培養(yǎng)18 h.以5%的接種量將培養(yǎng)液接入50 mL新鮮液體培養(yǎng)基中，同時接種多個搖瓶，其中一半搖瓶中各接入2 mL的體積分?jǐn)?shù)為25%的大蒜汁，另外一半搖瓶不加大蒜汁，37℃進行培養(yǎng).分別培養(yǎng)0.5 h、1.0 h、2.0 h、4.0 h、8.0 h、12.0 h，在560 nm處測定培養(yǎng)液的OD值.

2 結(jié)果與討論

2.1 大蒜汁對3種試驗菌最低抑菌濃度的測定

試驗結(jié)果如圖1～圖3所示.從試驗結(jié)果可知:大蒜液的濃度越高，殺菌效果越好，對于金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，體積分?jǐn)?shù)為25%的大蒜汁仍有抑菌作用，12.5%的大蒜汁幾乎沒有抑菌作用，可見大蒜汁對這兩種細菌的最低抑菌體積分?jǐn)?shù)均為25%.而12.5%大蒜汁對大腸桿菌仍有抑制作用，抑菌圈直徑達到2.1 cm，所以，大蒜對大腸桿菌的最低抑菌體積分?jǐn)?shù)為12.5%.可知大蒜汁對大腸桿菌的抑制作用強于金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌.

圖1 大蒜汁對金黃色葡萄球菌的最低抑菌體積分?jǐn)?shù)Fig.1 The minimum inhibitory concentration of garlic juice against S.aureus

圖2 大蒜汁對大腸桿菌的最低抑菌體積分?jǐn)?shù)Fig.2 The minimum inhibitory concentration of garlic juice against E.coli

圖3 大蒜汁對枯草桿菌的最低抑菌體積分?jǐn)?shù)Fig.3 The minimum inhibitory concentration of garlic juice against B.subtilis

2.2 溫度對大蒜汁抑菌作用的影響

體積分?jǐn)?shù)為25%大蒜汁分別在15℃、35℃、55℃、75℃和95℃的溫度下保溫處理1 h，其結(jié)果如表1所示.由表1可見:經(jīng)過不同溫度熱處理后的大蒜汁狀態(tài)發(fā)生了改變，在35℃時處理1 h后的大蒜汁抑菌作用已低于常溫狀態(tài)下的大蒜汁，且隨著溫度的升高，大蒜汁的抑菌效果逐漸下降，在溫度＞55℃時，大蒜汁的抑菌作用明顯減弱.當(dāng)大蒜汁熱處理超過75℃時，只對大腸桿菌抑制作用.

表1 溫度對大蒜汁抑菌作用的影響Table 1 The effection of inhibition of garlic juice by temperature

2.3 pH值對大蒜汁抑菌作用的影響

將體積分?jǐn)?shù)為25%的大蒜汁的pH值分別調(diào)節(jié)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，由表2可見:蒜汁在較寬pH值范圍內(nèi)均可產(chǎn)生抑菌效果，但在pH=5.0～6.0之間時抑菌效果較明顯，表明大蒜汁在弱酸性條件下抑菌活性較好.

表2 pH值對大蒜汁抑菌作用的影響Table 2 The effection of inhibition of garlic juice by pH

2.4 熱處理時間對大蒜汁抑菌作用的影響

在55℃下分別將大蒜汁處理不同的時間，熱處理時間對大蒜汁抑菌作用的影響見表3.由表3可見:處理0.5 h大蒜汁的抑菌效果最佳，處理1 h抑菌活性基本保持不變，在1.5 h時，抑菌作用開始減小，之后隨著時間的延長，抑菌作用逐漸減小直至消失，在處理3 h后對試驗菌株基本沒有了抑制作用.由此可知大蒜素在55℃下加熱會逐步失去活性.

表3 熱處理時間對大蒜汁抑菌作用的影響Table 3 The effection of inhibition of garlic juice by heat treatment time

2.5 大蒜汁對試驗菌株生長曲線抑制作用的測定

由圖4、5和6可知加入大蒜汁的菌懸液在開始時的吸光度略高于未加蒜汁的菌懸液.這是因為大蒜汁并未經(jīng)過離心，較混濁，所以，在較短的作用時間里由于蒜汁本身的濁度對OD值產(chǎn)生了影響.但在這之后，可明顯地觀察到加入大蒜汁的菌懸液OD值升高很緩慢，其菌體的生長速率明顯受到抑制.未加蒜汁的菌體生長過程隨時間的變化經(jīng)歷了延滯期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期及死亡期等4個時期，而加入大蒜汁的菌體生長趨勢明顯受到了抑制，沒有對數(shù)生長期，即沒有菌濃度迅速增加的過程，說明大蒜汁可明顯抑制試驗菌的生長，減少菌體數(shù)量.

圖4 大蒜汁對金黃色葡萄球菌生長曲線的抑制作用Fig.4 The inhibition of garlic juice against growth curve of S.aureus

圖5 大蒜汁對大腸桿菌生長曲線的抑制作用Fig.5 The inhibition of garlic juice against growth curve of E.coli

圖6 大蒜汁對枯草桿菌生長曲線的抑制作用Fig.6 The inhibition of garlic juice against growth curve of B.subtilis

3 結(jié)論

(1)大蒜汁的抑菌作用會受到試驗菌株種類、大蒜汁體積分?jǐn)?shù)、溫度、加熱時間、pH等因素的影響.

(2)大蒜汁對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的最低抑菌體積分?jǐn)?shù)分別為12.5%、25%和25%.

(3)大蒜汁隨著溫度的升高其抑菌作用逐漸減弱，當(dāng)溫度達到75℃時，大蒜汁只對大腸桿菌還有較弱的抑菌作用，在55℃下隨著熱處理時間的延長抑菌作用逐漸減弱，處理3 h后完全喪失抑菌作用.

(4)大蒜汁在弱酸性條件下對試驗菌株的抑菌作用較強，隨著酸性的增強抑菌作用逐漸減弱，在堿性下沒有抑菌作用.

(5)通過大蒜汁對3種試驗菌株生長曲線影響的測定可知大蒜汁可明顯抑制菌體的生長，減少菌體的數(shù)量.

［1］ 李娜.大蒜素的功效成分及其應(yīng)用的研究進展［J］.中國食物與營養(yǎng)，2007(11):25－27.

［2］ 陳雄，喬昕，林向東，等.大蒜油抗菌作用的初步研究［J］.中國調(diào)味品，2002(10):14－15.

［3］ 謝宗波，姜國芳，黃德娟.大蒜油的提取及抗菌活性研究［J］.食品科技，2007(8):130－131.

［4］ 何榮海，馬海樂.大蒜有效成分的提取研究進展［J］.食品科技，2004(10):40－42.

［5］ Ilker Darak.Effectys of Garlic Extract Consumption on Blood Lipid and Oxidant/antioxidant Parameters in Humans with High Bolld Clolesterol［J］.Journal of Nutritional Biochemistry，2004(15):373－377.

［6］ 王家埔，于克學(xué)，高翠希.大蒜油提取與應(yīng)用研究現(xiàn)狀［J］.保鮮與加工，2004(4):11－12.

［7］ 張寶善，王君，陳錦屏，等.大蒜汁對枯草芽孢桿菌抑制作用的研究［J］.西北植物學(xué)報，2009，29(6): 1269－1275.

［8］ 徐文靜，杜茜，趙洪錕，等.大蒜提取液抑菌活性及其穩(wěn)定性分析［J］.中國生物防治，2008，24(增刊):76－80.

［9］ 劉文群，李曼，徐爾尼，等.大蒜抑菌效果研究及與生姜的比較［J］.果蔬深加工，2006，22(3):71－72.

［10］周文化，張海玲，李瑤，等.大蒜酒體外抑菌試驗研究［J］.食品科技，2010，35(6):115－117.