乙酰乳香酸抑制日本血吸蟲蟲卵肉芽腫形成及其機制的探討＊

董勝鑒，劉 淼，黃大可，陳 鵬，任翠平，何宗平，沈際佳

乙酰乳香酸（ABA）是從乳香屬植物中提?。?］，它的藥用特性被廣泛認知，利用它的抗菌性主要治療炎癥、某些癌癥和促進傷口愈合［2－4］。最近發(fā)現(xiàn)樹脂中乳香酸還發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)進而起到抗炎和誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用，如治療炎癥性結(jié)腸炎、膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)病、哮喘等免疫性疾病以及誘導(dǎo)膠質(zhì)母細胞瘤細胞、人白血病細胞等凋亡［1］。

血吸蟲病是一種嚴重危害人類健康的人獸共患寄生蟲?。?］，它是以血吸蟲可溶性蟲卵抗原（SEA）引起的肉芽腫和纖維化為特點的免疫性疾?。?］。血吸蟲病患者主要死于蟲卵肉芽腫繼發(fā)的肝纖維化。目前國內(nèi)外尚無理想的抗血吸蟲病肝纖維化藥物，國內(nèi)外肝病學(xué)者普遍認為肝纖維化早期是可以逆轉(zhuǎn)的［7］，研究用中草藥有效成份（包括ABA）治療肝纖維化成為近期的熱點。

日本血吸蟲蟲卵肉芽腫中的巨噬細胞分泌白三烯B4（LTB4）［8］和前列腺素［9］等炎性介質(zhì)，LTB4作為一種對粒細胞和巨噬細胞強有力的趨化因子和激活因子主要參與炎癥免疫反應(yīng)和宿主對感染的抵御反應(yīng)［10］。ABA 抑制5－脂氧合酶（5－LO）的活性［11］，降低LTB4的生成，緩解炎癥的反應(yīng)。

鑒于乙酰乳香酸（ABA）能夠有效治療多種炎癥，本研究應(yīng)用ABA抑制日本血吸蟲卵肉芽腫炎癥反應(yīng)，并探討ABA對抑制肉芽腫形成的作用機理。

1 材料與方法

1．1 動物及釘螺 雌性C57鼠，SPF級，6周齡，重17～19g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，用標準顆粒飼料及高壓滅菌水喂養(yǎng)。感染日本血吸蟲尾蚴的陽性釘螺，購自江蘇省血吸蟲病防治研究所。

1．2 藥物及試劑 藥物乙酰乳香酸由德國烏爾姆大學(xué)Thomas Simmet教授提供，檢測LTB4的ELISA試劑盒購自美國R＆D公司，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑購自上海榮盛生物制品有限公司。

1．3 實驗分組及標本的留取 32只小鼠按SPF級標準飼養(yǎng)，隨機分五組，正常對照組（A組4只）、溶劑環(huán)糊精組（B組6只）、感染對照組（C組8只），ABA用藥量140mg／kg組（D組7只）、280mg／kg組（E組7只）。A組是未感染血吸蟲尾蚴的同期正常鼠，B、C、D和E四組經(jīng)腹部皮膚感染日本血吸蟲尾蚴20±2條，感染21天后，B組經(jīng)腹腔注射環(huán)糊精280mg／（kg·d）×20d，C組感染后不加治療，D和E組分別腹腔注射ABA 140mg／（kg·d）×20d和280mg／（kg·d）×20d。與感染后42天斷頸處死，收集血清；取小鼠肝組織中葉固定，制作組織切片。

1．4 血清ALT、AST、LTB4水平的檢測 全血室溫靜置30min，1 200g離心10min，分離血清－80℃凍存。血清ALT、AST的檢測按照轉(zhuǎn)氨酶試劑盒說明操作。血清LTB4的檢測按照ELISA試劑盒說明操作。

1．5 組織病理學(xué)檢查 小鼠肝組織中葉經(jīng)4%中性甲醛固定，石蠟包埋，制作厚4μm連續(xù)切片，經(jīng)蘇木素－伊紅（HE）染色后，從每組的每個樣本分別選取非連續(xù)小鼠肝組織切片兩張，用光學(xué)顯微鏡觀察每張切片的肝組織病變情況，并用JEDA 801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件進行分析，計算每張切片上肉芽腫纖維化面積占該切片總面積的百分比，取各組的平均值，以代表各組小鼠肝臟肉芽腫和纖維化的程度并進行統(tǒng)計學(xué)的分析。

1．6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13．0軟件對32例（分5組：A、B、C、D和E組）樣本進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組數(shù)據(jù)均值，選用獨立樣本t檢驗；組間數(shù)據(jù)比較，多組比較采用單因素方差分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 血清ALT、AST的水平 經(jīng)ABA治療E組的小鼠血清中ALT和AST水平低于B和C組，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05），D組雖較B和C組偏低，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）。E組的ALT的水平顯著高于A組，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05），而E組的AST水平雖高于A組，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）。測定轉(zhuǎn)氨酶數(shù)值見圖1。

圖1 乙酰乳香酸（ABA）對血清轉(zhuǎn)氨酶水平的影響Fig．1 Effect of acetyl boswellia acid（ABA）on serum transaminase levelsNote：＊Levels of AST and ALT in group E are significantly different from those of groups B and C（P＜0．05）．

2．2 肝蟲卵肉芽腫平均面積比較 A、B、C、D和E各組HE染色觀察肉芽腫狀態(tài)見圖2。E組肉芽腫面積顯著小于B和C組（P＜0．05），D組肉芽腫面積雖小于B和C組，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05），具體結(jié)果見表1。

圖2 各組HE染色肉芽腫面積的狀態(tài)代表圖Fig．2 Situation of HE staining granuloma in each group

表1 乙酰乳香酸（ABA）對蟲卵肉芽腫面積的影響Tab．1 Effect of acetyl boswellia acid （ABA）on size of egg granuloma

2．3 血清LTB4的水平 E組LTB4的水平明顯比B和C組低（P＜0．05），D組的LTB4水平比B和C組低，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05），E組的LTB4水平比A組高，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）。結(jié)果見圖3。

3 討 論

蟲卵肉芽腫是血吸蟲性肝纖維化的基本病變，其形成機制十分復(fù)雜。血吸蟲病可視為一種免疫性疾病，其免疫病理基礎(chǔ)是宿主免疫系統(tǒng)對組織內(nèi)成熟蟲卵所釋放的可溶性蟲卵抗原所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。經(jīng)ABA處理后組織病理學(xué)檢查顯示，E組的蟲卵肉芽腫面積比B和C組的小，D組的蟲卵肉芽腫的面積雖小于B和C組，但無統(tǒng)計學(xué)差異。說明ABA達到一定劑量時有利于肉芽腫的治療，可明顯減輕蟲卵肉芽腫的炎癥反應(yīng)。

圖3 乙酰乳香酸（ABA）對血清LTB4水平的影響Fig．3 Effect of acetyl boswellia acid（ABA）on serum level of LTB4Note：＊ Level of LTB4in group E is significantly different from that of groups B and C（P＜0．05）．

ALT和AST主要分布在肝臟的肝細胞內(nèi)。如果肝細胞壞死，ALT和AST就會升高，其升高的程度與肝細胞受損的程度相一致，這兩種酶在肝細胞內(nèi)的分布是不同的。ALT主要分布在肝細胞漿，AST主要分布在肝細胞漿和肝細胞的線粒體中。實驗表明給予ABA治療后，E組血清ALT、AST的水平比B和C組下降，說明ABA有利于肝細胞功能的恢復(fù)，對肉芽腫的治療有效果。從結(jié)果可看出ALT升高的幅度大于AST，可能是肉芽腫期，也即肝損傷早期，肝細胞的線粒體AST還未釋出的原因。

體外藥學(xué)實驗證明乙酰乳香酸（ABA）可能阻斷5－LO的活性，抑制 LTB4生成［12］。有文獻報道四氯化碳（CCL4）模型鼠，用ABA阻斷5－LO的活性而抑制LTB4的產(chǎn)生，減輕炎癥，緩解肝纖維化［13］。本實驗通過對血吸蟲模型鼠腹腔注射ABA治療后，用藥組血清LTB4的含量低于B和C組，說明ABA通過阻斷5－LO的活性，抑制了LTB4的生成，證實體內(nèi)實驗有抗血吸蟲蟲卵肉芽腫炎癥形成作用；E組LTB4的水平與A組無統(tǒng)計學(xué)差異差異，說明經(jīng)ABA治療后血清LTB4的水平受抑制，而接近正常鼠的水平，此點充分證明該藥對5－LO的明顯抑制作用，從而使LTB4的生成降低，緩解肉芽腫性炎癥，減輕肝纖維化的形成。血吸蟲蟲卵肉芽腫是免疫介質(zhì)和生化介質(zhì)均參與其調(diào)節(jié)的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)機制，本次實驗僅對生化介質(zhì)LTB4在肉芽腫炎癥中作用進行了初步的探討，其他介質(zhì)的作用有待進一步研究。

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