核糖核苷酸還原酶和非小細(xì)胞肺癌

許南榮 李輝 鄭雅文 閻云

肺癌在全世界是癌癥相關(guān)造成死亡的最常見原因，全球每年死于肺癌人數(shù)占所有死亡人數(shù)的3.1%，占所有癌癥死亡人數(shù)的17.6%，排第一位[1]。在臺(tái)灣，惡性腫瘤自1982年迄今，一直居十大死亡之首位。而其中15%-20%是因肺癌而死亡，據(jù)統(tǒng)計(jì)2010年死于肺癌的人數(shù)占所有癌癥死亡人數(shù)的20.0%（8,209/41,046），位居十大癌癥死亡原因第一位，且有逐年增加的趨勢(shì)[2]。癌癥發(fā)生的原因非常復(fù)雜，與先天遺傳、生活飲食習(xí)慣、居住環(huán)境、職業(yè)等內(nèi)外因素有關(guān)，流行病學(xué)調(diào)查顯示肺癌的發(fā)生和吸煙（包括二手煙）、空氣污染、職業(yè)因素（如石棉）、放射線物質(zhì)（如氡氣）、遺傳因素、慢性疾病、性別因素、病毒感染（如人乳頭狀病毒）或其它危險(xiǎn)因素有關(guān)。

和其它許多癌癥類似，肺癌的發(fā)生源于癌基因的激活，或抑癌基因的失活[3]。癌基因指的是那些使人容易得癌癥的基因。通常認(rèn)為原癌基因在遇到致癌物以后會(huì)變成癌基因[4]。大鼠肉瘤蛋白（ratsarcoma, RAS）原癌基因的突變大約造成10%-30%的肺腺癌[5,6]。表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor, EGFR）控制著細(xì)胞的分裂、凋零，抑制血管生成和腫瘤侵蝕[5]。EGFR基因突變和擴(kuò)增在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中很常見，因此才有采用EGFR抑制劑的治療基礎(chǔ)。染色體損傷會(huì)導(dǎo)致基因雜合缺失，這可造成抑癌基因失活。多種基因多態(tài)性和肺癌有關(guān)，包括白細(xì)胞介素-1[7]、細(xì)胞色素P450[8]、細(xì)胞凋亡的促進(jìn)因子（比如caspase-8）[9]和DNA修復(fù)分子（比如XRCC1）[10]。攜帶這些基因多態(tài)性的人在接觸致癌物質(zhì)后更容易罹患肺癌。最近的研究[11]發(fā)現(xiàn)對(duì)位基因MDM2 309G也是亞洲人得肺癌的一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素。

核糖核苷酸還原酶（ribonucleotide reductase, RR）在將核苷酸雙磷酸轉(zhuǎn)化為2'-脫氧核苷酸雙磷酸中扮演一必要的角色，接著形成脫氧核苷酸三磷酸，用來提供DNA合成和修復(fù)過程必需的RR。因此RR的表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)定位和功能中都受到高度調(diào)節(jié)[12]。因?yàn)镽R在DNA合成中扮演如此關(guān)鍵的角色，所以它也是癌癥治療重要的標(biāo)靶[13]。有關(guān)RR和肺癌的相關(guān)問題，本文綜述如下。

1 RR的分子結(jié)構(gòu)與相關(guān)研究

在RR全酶的分子中，包括一個(gè)α大次級(jí)單位和一個(gè)β小次級(jí)單位組合成一個(gè)α2β2異四分子，RR的活性需要這樣的分子組成[12]。在人類，RR已被確認(rèn)具有一個(gè)大次級(jí)單位（M1）和兩個(gè)小次級(jí)單位（hRRM2和p53R2）[14]。大次級(jí)單位（hRRM1）包括基質(zhì)和異位作用位置，可以控制RR全酶活性和基質(zhì)特異性[15,16]，RR次小分子形成兩個(gè)對(duì)等中心含鐵雙核，這使得酪氨酸自由基穩(wěn)定，可在催化時(shí)啟動(dòng)電子傳遞[15,17]。RR兩個(gè)小次級(jí)單位（hRRM2和p53R2）的蛋白質(zhì)序列有80%的相似度[14]。試管測定發(fā)現(xiàn)組合成p53R2的蛋白質(zhì)和hRRM2都會(huì)和hRRM1作用而形成一全酶，使得胞嘧啶核苷酸雙磷酸（CDP）轉(zhuǎn)化成脫氧胞嘧啶核苷酸雙磷酸（dCDP）[18,19]。雙鐵雙酪氨酸關(guān)鍵中心被認(rèn)定是RR活性中心，位于p53R2和hRRM2共同凹袋結(jié)構(gòu)結(jié)合位置[20]，使用一合成八勝肽分子抑制RR活性，發(fā)現(xiàn)p53R2會(huì)經(jīng)由與hRRM2一樣的主控結(jié)合位置和hRRM1結(jié)合[20]。

p53R2和hRRM2是RR兩個(gè)小次級(jí)單位，兩者有一些不一樣的特征，p53R2一直被認(rèn)為是p53核蛋白的轉(zhuǎn)錄標(biāo)靶[14,21,22]。而在轉(zhuǎn)錄時(shí)hRRM2是被細(xì)胞周期有關(guān)因子如NF-Y[23,24]和E2F[25,26]所調(diào)控。在正常生理情況下，hRRM1和p53R2可以在G1-G0時(shí)被探測出來；但是在不分裂的休息細(xì)胞中hRRM1似乎不會(huì)去結(jié)合p53R2或涉入脫氧核糖核苷酸三磷酸（dNTPs）的合成[21,26]。研究[27]發(fā)現(xiàn)不增殖細(xì)胞并不具有RR活性，造成細(xì)胞中脫氧核糖核苷酸三磷酸（dNTPs）濃度較低；而在增殖細(xì)胞中，hRRM2在細(xì)胞位置和表達(dá)則與S期有關(guān)[27,28]。

在野生型p53細(xì)胞中，面對(duì)DNA受損的反應(yīng)，p53R2（而不是hRRM2）會(huì)參于 DNA修復(fù)。然而，當(dāng)p53沒有功能，在面對(duì)UV照射時(shí)， hRRM2能夠補(bǔ)充p53R2功能[29]。由于p53R2和hRRM2在結(jié)構(gòu)和功能上的不同，激起許多學(xué)者對(duì)RR兩個(gè)小次級(jí)單位更進(jìn)一步的研究。

2 RR和癌化研究

研究[30]發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞成長、侵犯和進(jìn)一步轉(zhuǎn)移可能涉及成長因子Ras/Raf/mitogen被活化蛋白激酶的信號(hào)傳遞路徑，這需要一些相關(guān)基因被活化。合成的小老鼠核糖核苷酸還原酶小次級(jí)單位R2（與人類的M2同質(zhì)）過度表達(dá)時(shí)會(huì)造成膜相關(guān)Raf-1表達(dá)增加30%、MAPK-2活性增加70%以及Rac-1活性增加3倍，造成在BALB/c 3T3和 NIH 3T3細(xì)胞會(huì)有很明顯的轉(zhuǎn)移潛力增加[31]。這些發(fā)現(xiàn)顯示R2蛋白不僅是RR的一個(gè)速率限制因子，而且能夠和一些致癌基因包括v-fms、v-src、A-raf、v-fes、c-myc和ornithine decarboxylase合作，提升惡性轉(zhuǎn)型和癌化作用[32]。有趣的是，小老鼠和人類細(xì)胞株的基因轉(zhuǎn)殖實(shí)驗(yàn)[20,33]都發(fā)現(xiàn)核糖核苷酸還原酶大分子M1（小老鼠是R1）具有抑制惡性潛力的作用。最近Rahman等[34]發(fā)現(xiàn)以小白鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，將RRM2以RNA干擾（RNA interference, RNAi）剔除，會(huì)強(qiáng)烈抑制頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株和NSCLC細(xì)胞株的生長，并且將針對(duì)RR次級(jí)單位M2（RRM2）的短干擾RNA（short interfering RNA, siRNA）納米粒子由靜脈打入，會(huì)抑制腫瘤侵犯并抑制細(xì)胞的增生，進(jìn)而造成細(xì)胞凋亡。有關(guān)p53R2分子作用機(jī)制，Zhang等[35]針對(duì)p53R2的受酶特征和抑制p53R2的試管研究發(fā)現(xiàn)，p53R2和hRRM2對(duì)hRRM1的結(jié)合力不同，hRRM2對(duì)hRRM1的結(jié)合力是p53R2對(duì)hRRM1的結(jié)合力的4.76倍，而RR抑制劑Triapine，則對(duì)p53R2和hRRM2的作用強(qiáng)度一樣。這些研究可以對(duì)癌癥治療有一新的指引方向[18]。Zhang等[35]發(fā)現(xiàn)p53R2抑制人類癌細(xì)胞增殖，是通過上調(diào)p21、下調(diào)cyclin D1，使細(xì)胞生長循環(huán)停止，因此，p53R2不僅在修補(bǔ)DNA受損，而且也在人類癌細(xì)胞增生中扮演關(guān)鍵角色[35]。Piao等[36]最近的研究發(fā)現(xiàn)MEK2可通過與p53R2作用， 調(diào)節(jié)RR活性，如減少M(fèi)EK2的活性，使RR活性明顯減少，說明p53R2受到MEK2-dependent途徑的調(diào)解具有特異性。

3 RR在NSCLC患者的相關(guān)轉(zhuǎn)譯研究

3.1 RRM1、RRM2和p53R2表達(dá)在臨床研究中的意義Bepler等[37]探討RRM1和PTEN表達(dá)對(duì)NSCLC患者預(yù)后的臨床意義，發(fā)現(xiàn)RRM1的表達(dá)與PTEN表達(dá)和RRM2表達(dá)明顯相關(guān)，而RRM1和PTEN高表達(dá)患者存活較久且疾病復(fù)發(fā)較晚。多元變項(xiàng)分析發(fā)現(xiàn)RRM1高表達(dá)是預(yù)測長期生存的因素，與腫瘤分期、生活狀態(tài)和體重減輕無關(guān)。Zheng等[38]研究187例僅接受手術(shù)治療的NSCLC，發(fā)現(xiàn)RRM1高表達(dá)的病患（＞120個(gè)月）比RRM1低表達(dá)的病患（54.5個(gè)月）的存活率好，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由于RRM1一直被學(xué)者認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)化學(xué)藥劑吉西他濱的目標(biāo)，RRM1在許多類型腫瘤病患中都被研究過，例如NSCLC、胰臟癌、乳腺癌、膽道癌。當(dāng)這些病患使用吉西他濱治療時(shí)，RRM1 mRNA的表達(dá)和基因的變異都會(huì)與這些病患的臨床預(yù)后有關(guān)[39]。而Zhou等[40]報(bào)道使用hRRM2單克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，在人類結(jié)腸癌、胃癌、肝癌、肺癌、胰臟癌和乳腺癌中hRRM2均有較強(qiáng)染色。研究結(jié)果建議可使用此抗hRRM2單克隆抗體做RR的研究和作為腫瘤癌化標(biāo)記物。Simon等[41]最近的研究顯示，針對(duì)NSCLC末期病患，可根據(jù)ERCC1和RRM1表達(dá)高低調(diào)制不同的化療治劑，如RRM1表達(dá)低，則使用吉西他濱；RRM1表達(dá)高，則使用長春瑞濱或多西他賽；ERCC1表達(dá)高，則使用多西他賽；ERCC1表達(dá)低，則使用卡鉑。如此量身打造的化學(xué)治療會(huì)比一般常規(guī)使用化學(xué)治療得到明顯較長的存活率。至于p53R2表達(dá)在NSCLC中的臨床研究，文獻(xiàn)并不多見。Uramoto等[42]研究結(jié)果不支持p53R2表達(dá)在NSCLC中可以發(fā)揮重要的預(yù)后作用，p53R2介導(dǎo)的DNA修復(fù)途徑可能負(fù)責(zé)控制肺癌的增長。然而Hsu等[43]研究發(fā)現(xiàn)p53R2蛋白表達(dá)在早期NSCLC中與癌細(xì)胞分化有負(fù)向相關(guān)。p53R2陽性表達(dá)明顯有較好的存活率（P=0.022）。這點(diǎn)和Uramoto等[42]報(bào)道不同。因此，我們認(rèn)為p53R2表達(dá)在晚期和早期NSCLC病患中可能扮演不同角色。有趣的是在食道癌中也有同樣的發(fā)現(xiàn)，學(xué)者報(bào)告在食道癌和口腔癌中p53R2表達(dá)與腫瘤侵犯性、淋巴腺轉(zhuǎn)移和腫瘤大小有關(guān)[44,45]，而p53R2在晚期食道癌比早期病患中表達(dá)較高[44]。Hsu等[46]為了探討p53R2和hRRM2在腫瘤進(jìn)行的角色，以免疫組織化學(xué)在染色組織微列陣中，探討p53R2和hRRM2蛋白在NSCLC中的表達(dá)。對(duì)92例早期NSCLC病例進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)25例表達(dá)hRRM2，占27.2%；而42例表達(dá)p53R2，占45.6%。Kaplan-Meier分析顯示p53R2陰性表達(dá)病患比p53R2陽性表達(dá)病患的平均整體存活天數(shù)短（660 d vs 900 d, P=0.025）。另外發(fā)現(xiàn)hRRM2陽性表達(dá)病患比hRRM2陰性表達(dá)病患的平均整體存活天數(shù)短（660 d vs 960 d, P=0.044）。此外，p53R2+/hRRM2-或p53R2-/hRRM2-病患比p53R2-/hRRM2+或p53R2+/hRRM2+病患的存活率高（P=0.003）。研究[46]發(fā)現(xiàn)p53R2蛋白表達(dá)在早期NSCLC中是一個(gè)有利預(yù)后因素和預(yù)測復(fù)發(fā)生物因子，p53R2蛋白表達(dá)在早期肺癌似乎比hRRM2更重要。p53R2蛋白表達(dá)不僅可作為整體存活率的獨(dú)立生物因子，也可以當(dāng)作腫瘤復(fù)發(fā)的指示劑。

3.2 有關(guān)RR抑制劑的研究 Tu等[47]1999年開始使用小白鼠做研究，以RRM1反義：GTI-2501，作為RRM1抑制劑，針對(duì)各種不同人類腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行試驗(yàn)，包括肺癌、乳癌、結(jié)腸癌、腎臟癌、卵巢癌、胰臟癌及皮膚癌。GTI-2501是20 mer反義寡核苷酸相對(duì)位于RRM1的編碼區(qū)。試管研究發(fā)現(xiàn)GTI-2501會(huì)降低RRM1 mRNA和蛋白的含量。此外，GTI-2501會(huì)抑制人類肺癌、肝癌、卵巢癌、腦癌、黑色素瘤、乳癌、 胰臟癌細(xì)胞的成長。生物體研究也發(fā)現(xiàn)GTI-2501明顯抑制裸鼠的結(jié)腸癌、胰臟癌、肺癌、乳癌、腎臟癌、卵巢癌、黑色素瘤、星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生長。以GTI-2501治療人類乳腺癌和小白鼠腎腫瘤會(huì)造成腫瘤完全消退。GTI-2501可抑制裸鼠黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到肺部并延長裸鼠淋巴瘤的存活率。這些結(jié)果說明GTI-2501可作為選擇性和特定的抗癌劑[48]。Shibata等[49]針對(duì)末期轉(zhuǎn)移腫瘤，使用RRM2抑制劑GTI-2040聯(lián)合奧沙利鉑和卡培他濱，進(jìn)行第一期臨床試驗(yàn)，認(rèn)為這是可行的治療方法。

Klisovic等[50]針對(duì)成人復(fù)發(fā)/難治性急性髓細(xì)胞白血病，使用RRM2反義：GTI-2040，抑制RRM2，聯(lián)合高劑量阿糖胞苷進(jìn)行第一期臨床試驗(yàn)。2001年Orr等[51]以GTI-2040進(jìn)行第一/二期臨床試驗(yàn)，并針對(duì)腎臟癌和大腸癌作為單一治療藥劑進(jìn)行第二期臨床試驗(yàn)。但在2008年Stadler等[52]針對(duì)腎臟癌病患，使用GTI-2040和卡培他濱進(jìn)行第一/二期臨床試驗(yàn)，因?yàn)镽RM2在細(xì)胞中的表達(dá)出現(xiàn)變異的數(shù)據(jù)，認(rèn)為還需進(jìn)一步研究。Leighl等[53]針對(duì)末期NSCLC，使用GTI-2040聯(lián)合多西他賽進(jìn)行第一/二期臨床試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)結(jié)果并不優(yōu)于以前單獨(dú)使用多西他賽治療NSCLC。

Aye等[54]在試管內(nèi)針對(duì)3種哺乳類細(xì)胞株研究，發(fā)現(xiàn)Triapine可以在30 min內(nèi)直接對(duì)p53R2內(nèi)鐵螯合，使p53R2失去活性。Mortazavi等[55]以Triapine長期灌注和固定劑量吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用于末期固體腫瘤，進(jìn)行第一期臨床試驗(yàn)，探討Triapine最大耐受劑量、安全性、藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)和有效性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在30例病患中，有1例部分反應(yīng)，15例病況穩(wěn)定。而Triapine已在進(jìn)行第二期臨床試驗(yàn)[54]?？傊?，有關(guān)RR抑制劑的研究，目前學(xué)者不管在基礎(chǔ)或臨床的研究都持續(xù)在努力，期待對(duì)癌癥治療提供另一種有利的選擇。

4 展望

RR的研究，經(jīng)由基礎(chǔ)研究對(duì)結(jié)構(gòu)分子的了解，到研究探討大次級(jí)單位（RRM1）、小次級(jí)單位（RRM2、p53R2）和各類癌癥的相關(guān)性，到RR抑制劑（包括如化療制劑：羥基脲、吉西他濱；鐵螯合劑：Triapine；以及反義寡核苷酸：GTI-2501和GTI-2040），進(jìn)行臨床前期的第一/二期試驗(yàn)的系列研究，為人類提供一條對(duì)抗癌癥可行的路徑。RR可作為抗癌的標(biāo)定物，因?yàn)樗荄NA合成和修補(bǔ)的關(guān)鍵分子；在許多腫瘤和細(xì)胞株的研究中發(fā)現(xiàn)它常會(huì)增加表達(dá)并增加酶的活性；會(huì)和一些已知的致癌基因（v-fms, v-src, A-raf, v-fes, c-myc, ODC）一起作用促成細(xì)胞轉(zhuǎn)型和癌化潛能；已知RRM2具有抗癌作用；RRM2表達(dá)增多會(huì)促使癌細(xì)胞具有侵犯潛能；RR表達(dá)增多具有抗藥性，這些研究的結(jié)果讓人類對(duì)抗癌癥充滿期待。尤其最近以納米粒子作為RR的siRNA的運(yùn)送方式正方興未艾。而有關(guān)RR抑制劑，目前仍有一些問題需要解決，包括半衰期太短、藥物抑制太快、本身有部分被抑制、會(huì)有可逆性的結(jié)合現(xiàn)象等，相信經(jīng)由學(xué)者和臨床研究的攜手合作，許多問題都可以逐漸理清，為人類對(duì)抗癌癥的努力做出貢獻(xiàn)。