膠體金法結(jié)合涂片形態(tài)學特征快速鑒別結(jié)核分枝桿菌復合群的應用評價

黃明翔 張麗水 陳新朝 毛文捷

我國是結(jié)核病高負擔國家之一，患病人群數(shù)量巨大，面臨著嚴峻的結(jié)核病流行形勢［1］。同時，近年來由于氣候、環(huán)境等因素，非結(jié)核分枝桿菌（non－tuberculosis Mycobacterium，NTM）感染具有明顯的上升趨勢，2000年調(diào)查表明，我國NTM菌株占全部分枝桿菌菌株的11.1%［2］，較1984—1985年的4.2%，1990年的4.9%明顯增高。非結(jié)核分枝桿菌感染的臨床癥狀和X線表現(xiàn)與結(jié)核相似，難以鑒別，且多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌對抗結(jié)核藥物有天然耐藥性，因此正確鑒定結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌對于疾病的診斷和治療至關(guān)重要［3］。

傳統(tǒng)的微生物學鑒定方法過于復雜、費時，而分子生物學鑒定方法由于儀器、試劑價格昂貴，也難以在日常的實踐中推廣。臨床迫切需要一種快速、簡易鑒別結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的方法。本研究運用涂片抗酸染色和結(jié)核分枝桿菌抗原膠體金法，對BACTEC MGIT 960培養(yǎng)陽性853株臨床分離株進行菌種鑒定并與傳統(tǒng)生化鑒定方法比較，以評價這兩種方法在分枝桿菌菌種鑒定中的作用。

材料和方法

一、標本及菌株來源

標本來源于我院2011年1—6月門診及住院肺結(jié)核或疑似患者，選擇門診及住院的肺結(jié)核患者或是咳嗽、咯痰≥2周或有咯血或血痰者等具有肺結(jié)核可疑癥狀者為研究人群，所有確診及疑似肺結(jié)核患者的診斷均根據(jù)《結(jié)核病分類》（WS196－2001）中的診斷標準［4］執(zhí)行。共收集1260例確診肺結(jié)核患者和1350例疑似患者的標本進行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)。2610例送檢培養(yǎng)的標本中痰標本1580例，肺泡灌洗液921例，胸腔積液109例。經(jīng)BACTEC MGIT 960培養(yǎng)共收集培養(yǎng)陽性，抗酸染色證實為分枝桿菌菌株853株。質(zhì)控菌株：結(jié)核分枝桿菌標準菌株 H37Rv（ATCC27294）、偶然分枝桿菌（ATCC6841）來源于北京胸科醫(yī)院國家參比實驗室。

二、儀器和試劑

BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌檢測儀及配套試劑為美國BD公司生產(chǎn)。ABI7300熒光定量擴增儀為美國應用生物（Applied Biosystems）公司生產(chǎn)、結(jié)核分枝桿菌核酸擴增（PCR）熒光檢測試劑盒為中山大學達安基因股份有限公司生產(chǎn)?？顾崛旧?、改良酸性羅氏培養(yǎng)基、對硝基苯甲酸（PNB）、噻吩－2－羧酸肼（TCH）培養(yǎng)基及生化鑒定的試劑為本實驗室參照中國防癆協(xié)會制定的《結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》［5］自配。結(jié)核分枝桿菌膠體金檢測試劑盒購自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司。

三、實驗方法

（一）分枝桿菌培養(yǎng)和涂片檢查

送檢標本經(jīng)2～3倍消化液（30 mmol N－乙酰基L－半胱氨酸＋2%氧化鈉＋2%檸檬酸三鈉）消化處理15 min后，加生理鹽水稀釋至50 ml，4200轉(zhuǎn)/min（離心半徑15 cm）離心20 min后，棄去上清，用2～3 ml生理鹽水稀釋沉淀物，取約50μl接種到BACTEC MGIT 960培養(yǎng)管。一旦有陽性，系統(tǒng)會報告，從培養(yǎng)管里取樣做抗酸染色，在1000倍普通光學顯微鏡下觀察和記錄。

（二）傳統(tǒng)菌種鑒定實驗

1.結(jié)核分枝桿菌復合群與非結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)生化鑒定實驗：應用PNB和TCH鑒別培養(yǎng)基生長實驗對菌種進行初步鑒定，操作步驟參照《結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》［5］進行。鑒定結(jié)果：結(jié)核分枝桿菌復合群PNB陰性TCH陽性；非結(jié)核分枝桿菌PNB陽性TCH陽性。

2.分枝桿菌菌種鑒定實驗：按照中國防癆協(xié)會制定的《結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》［6］的方法進行。

（三）結(jié)核分枝桿菌復合群實時熒光定量PCR鑒定

1.操作步驟：取1 ml混勻后的培養(yǎng)菌液，15 000 r/min（離心半徑8 cm），離心5 min，棄上清，沉淀加無菌生理鹽水1 ml打勻15 000轉(zhuǎn)/min（離心半徑8 cm），離心5 min，再重復1次，沉淀加50μl DNA提取液，置沸水浴10 min。10 000 r/min（離心半徑8 cm），離心5 min，取上清液2μl，加入成品的結(jié)核分枝桿菌核酸擴增（PCR）熒光檢測試劑盒中（包含引物、耐熱DNA聚合酶、四種核苷酸單體等），按儀器說明進行PCR反應。

2.結(jié)果判定：依照說明書設(shè)定陰性質(zhì)控品擴增循環(huán)數(shù)（Ct值）為≥30，臨界陽性質(zhì)控品Ct值為27～29，強陽性質(zhì)控品Ct值為＜22。當陰性質(zhì)控品Ct值＞臨界陽性質(zhì)控品Ct值＞強陽性質(zhì)控品Ct值時，判定實驗有效，在此前提下根據(jù)檢測標本的Ct值判定結(jié)果，如果檢測標本的Ct值≥30則判定為陰性，Ct值＜30則為陽性。

（四）結(jié)核分枝桿菌抗原膠體金法快速診斷實驗

從培養(yǎng)陽性MGIT 960試管中取100μl樣品加入結(jié)核分枝桿菌膠體金檢測試劑盒的檢測孔中，15 min后觀察結(jié)果。結(jié)果判定：檢測區(qū)和控制區(qū)均出現(xiàn)紫紅色條帶為陽性結(jié)果，在控制區(qū)出現(xiàn)紫紅色條帶，在檢測區(qū)未出現(xiàn)為陰性結(jié)果?？刂茀^(qū)未出現(xiàn)任何條帶需重新檢測。

四、統(tǒng)計學方法

采用敏感度、特異度、陽性預測值（positive predictive value，PPV）和陰性預測值（negative predictive value，NPV）評價實驗方法陽性的有效性。敏感度＝真陽性/（真陽性＋假陰性）；特異度＝真陰性/（真陰性＋假陽性）；PPV＝真陽性/（真陽性＋假陽性）；NPV＝真陰性/（真陰性＋假陰性）。

結(jié) 果

一、BACTEC MGIT 960培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

2610例臨床標本BACTEC960培養(yǎng)陽性，經(jīng)抗酸染色證實為分枝桿菌853株（32.7%）。經(jīng)過傳統(tǒng)生化反應鑒定其中結(jié)核分枝桿菌復合群760株，非結(jié)核分枝桿菌91株，結(jié)核分枝桿菌復合群和非結(jié)核分枝桿菌混合生長2株。鑒定結(jié)果見表1。

表1 傳統(tǒng)生化反應對853株菌種分類的鑒定結(jié)果

圖1～4 液體培養(yǎng)基沉淀物涂片抗酸染色形態(tài)。圖1示結(jié)核分枝桿菌復合群呈典型索狀生長（抗酸染色 ×1000）；圖2示龜分枝桿菌呈團塊排列（抗酸染色 ×1000）；圖3示鳥－胞內(nèi)分枝桿菌復合體呈團塊排列（抗酸染色 ×1000）；圖4示膿腫分枝桿菌呈散在分布（抗酸染色 ×1000）

二、BACTEC MGIT 960中分枝桿菌涂片抗酸染色結(jié)果

經(jīng)傳統(tǒng)生化方法鑒定為結(jié)核分枝桿菌復合群760株中，經(jīng)吸取液體培養(yǎng)基沉淀物涂片抗酸染色呈索狀排列的有748株，非索狀排列的12株，其中束狀排列10株，成團排列2株。非結(jié)核分枝桿菌則呈現(xiàn)團塊狀排列、散在分布等不規(guī)則排列，3株非結(jié)核分枝桿菌包括戈登分枝桿菌1株、偶然分枝桿菌2株呈索狀排列。2株混合生長菌株則同時存在索狀和非索狀排列的情況。涂片法鑒別結(jié)核分枝桿菌敏感度為98.4%（750/762），特異度為96.7%（88/91）。PPV為99.6%（750/753）；NPV為88.0%（88/100）。詳見圖1～4及表2。

三、實時熒光定量PCR鑒定結(jié)果

760株結(jié)核分枝桿菌復合群和2株混合生長株實時熒光定量PCR檢測結(jié)果均為陽性；91株非結(jié)核分枝桿菌為陰性。

四、結(jié)核分枝桿菌復合群抗原膠體金試驗檢測結(jié)果

具體見表3。752株結(jié)核分枝桿菌復合群和2株混合生長菌株膠體金試驗呈陽性反應，8株結(jié)核分枝桿菌復合群呈陰性反應并重復3次試驗仍然呈陰性反應；91例非結(jié)核分枝桿菌中90例呈陰性反應，1例鳥胞復合體呈弱陽性反應，該株同樣經(jīng)過3次重復試驗結(jié)果均為弱陽性。膠體金試驗鑒別結(jié)核分枝桿菌敏感度為 99.0% （754/762），特 異 度 為98.9%（90/91），PPV 為99.9%（754/755），NPV為91.8%（90/98）。

五、結(jié)合涂片抗酸染色和膠體金試驗兩種方法鑒別結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果

結(jié)合兩種方法對MGIT 960培養(yǎng)陽性菌株進行判斷，當菌株涂片呈索狀且膠體金陽性時即可判定該菌株含有結(jié)核分枝桿菌復合群，PPV為100.0%（741/741）；當菌株涂片不呈索狀且膠體金陰性時可判定該菌株為非結(jié)核分枝桿菌，NPV 100.0%（87/87）；當只有其中一種方法陽性時，則需通過傳統(tǒng)PNB法或分子生物學方法進一步進行判斷（表4）。

表2 760株結(jié)核分枝桿菌復合群與非結(jié)核分枝桿菌抗酸染色檢測菌落排列形態(tài)（株）

表3 BACTEC MGIT 960培養(yǎng)陽性分離株膠體金試驗檢測結(jié)果（株）

表4 結(jié)合涂片抗酸染色和膠體金試驗兩種檢測方法鑒別結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果（株）

討 論

BACTEC MGIT 960系統(tǒng)是一種基于液體培養(yǎng)基的分枝桿菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)，針對其陽性培養(yǎng)物的鑒定，目前國內(nèi)實驗室主要還是采用傳統(tǒng)的鑒定方法，但所需時間長，不能滿足臨床快速診斷的需求。近年來興起的分子生物學技術(shù)對實驗室的儀器、實驗人員的能力要求較高，試劑成本昂貴，很難在基層醫(yī)院推廣。臨床急需一種快速簡便、準確性高的方法。

在液體培養(yǎng)基中，結(jié)核分枝桿菌因含索狀生長因子而在顯微鏡下呈現(xiàn)特有的索狀排列，而非結(jié)核分枝桿菌則較少存在索狀因子故呈現(xiàn)團塊狀排列、散在分布等不典型形態(tài)，因此索狀排列形態(tài)被推薦作為一種結(jié)核分枝桿菌復合群的鑒定標準［7］。對于BACTEC MGIT 960分枝桿菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)報告陽性的菌株應立即進行涂片抗酸染色，不但可以排除非抗酸菌引起的污染，而且可以通過鏡下形態(tài)特征能夠?qū)N類型進行初步判斷。本研究結(jié)果顯示，快速涂片鑒定的敏感度為98.4%，特異度為96.7%，具有良好的初步判斷能力。國外有研究報道［8］，應用該法鑒定結(jié)核分枝桿菌復合群的敏感度、特異度分別為92.1%和96.4%，與本研究結(jié)果相近。

結(jié)核分枝桿菌抗原膠體金法是一種用單克隆抗體檢測結(jié)核分枝桿菌分泌的MPT64（也稱“MPB64”）蛋白的方法，MPT64蛋白主要存在于結(jié)核分枝桿菌復合群，非結(jié)核分枝桿菌中僅有極少數(shù)存在［9］。該方法快速，簡便，不需要特殊的儀器，只需15 min便能得到結(jié)果，而傳統(tǒng)的PNB生長試驗需要4周時間。近年來，國內(nèi)外許多學者均報道了應用該法快速鑒定結(jié)核分枝桿菌復合群。如Hillemann等［10］研究表明膠體金法檢測結(jié)核分枝桿菌復合群的敏感度為92.4%，特異度為100.0%；國內(nèi)陳俊林等［11］利用此法對131株分枝桿菌臨床分離株進行檢測，其敏感度為99.1%，特異度為100.0%。在本研究中通過對853株臨床分離株進行檢測，結(jié)核分枝桿菌抗原膠體金法的敏感度為99.0%，特異度為98.9%，PPV為99.9%，NPV 為91.8%，與報道基本相符。其中，8株結(jié)核分枝桿菌分離株呈陰性反應，它們可能存在MPT64編碼基因突變［12］；另外，1株鳥胞復合體呈弱陽性反應，這株特殊的菌株經(jīng)過菌種復蘇后重新檢測仍呈陽性反應，同時該株的實時熒光定量PCR檢測結(jié)果為陰性，表明該菌株中不存在結(jié)核分枝桿菌復合群。國外多個文獻也報道了該法對于不同種類非結(jié)核分枝桿菌呈假陽性反應的結(jié)果［13－14］，其原因還有待于進一步研究。

本研究顯示，單一使用涂片法或膠體金法進行鑒定，都有可能出現(xiàn)漏診或誤診的現(xiàn)象，而結(jié)合兩種方法進行判斷則可大幅度提升診斷的準確程度。當陽性培養(yǎng)物涂片顯示索狀排列且膠體金陽性時，可報告菌株中含有結(jié)核分枝桿菌復合群，其陽性預測值為100.0%；兩種方法均為陰性，可報告為非結(jié)核分枝桿菌，其陰性預測值為100.0%；而只有任一種方法陽性，則需進一步鑒定。通過結(jié)合涂片法和膠體金法兩種方法，853株菌株中97.1%（828株）得到快速鑒定，僅有25株需要進一步鑒定，極大提高了檢驗效率。

另外，需要提到的是91株非結(jié)核分枝桿菌中有1株恥垢分枝桿菌，由于本院對于初步鑒定為非結(jié)核分枝桿菌的標本都要求患者再次送檢，經(jīng)過鑒定兩次送檢的標本均為恥垢分枝桿菌，因此可以排除實驗操作、標本留取過程中的污染。同時，病歷資料顯示該患者并沒有處于免疫狀態(tài)極其低下的狀況，故考慮該菌為患者體內(nèi)定植的非致病性細菌。

綜上所述，無論是涂片法還是膠體金法，都是快速、簡便的方法，兩種方法的結(jié)合，可提高診斷的準確性，可作為分枝桿菌菌種鑒定的有效方法，且適于各級實驗室使用。

［1］全國第五次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查技術(shù)指導組.2010年全國第五次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查報告.中國防癆雜志，2012，34（8）：485－508.

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