野生獼猴STLV-1和B病毒抗體的檢測(cè)

李常挺 ，盤(pán)寶進(jìn) ，謝永平 ，李 軍 ，陳澤祥 ，楊 威

（1.隆安縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西隆安 532700；2.廣西出入境檢驗(yàn)檢疫局國(guó)家靈長(zhǎng)類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530021；3.廣西獸醫(yī)研究所，廣西南寧 530001；4.廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001）

廣西地處亞熱帶，特別適合于獼猴生長(zhǎng)繁殖，多個(gè)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)繁衍有野生獼猴，廣西從未對(duì)野生獼猴T淋巴細(xì)胞白血病病毒1型（STLV-1）、獼猴皰疹病毒I型（B病毒）和免疫缺陷病毒3種病毒進(jìn)行過(guò)抗體檢測(cè)。2012年2月23日，接到某自然保護(hù)區(qū)報(bào)告，有1只野生獼猴發(fā)病瀕臨死亡，應(yīng)保護(hù)區(qū)要求，對(duì)發(fā)病現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行了調(diào)查，抽取血液分離血清，對(duì)死亡病猴剖檢觀察記錄病變情況，采集臟器實(shí)驗(yàn)室分離細(xì)菌，檢測(cè)血清樣品中猴3種主要病毒的抗體，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 發(fā)病經(jīng)過(guò)及臨床檢查

2月23日上午，工作人員在自然保護(hù)區(qū)內(nèi)進(jìn)行定期線(xiàn)路巡查監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)有1 只母猴精神沉郁，走路搖擺不定、單只落伍，隨后該猴倒地不能行走。將該猴裝入鐵籠內(nèi)帶回管理處作進(jìn)一步觀察，猴病情進(jìn)一步惡化，精神極度萎靡，兩眼目光呆滯，現(xiàn)場(chǎng)測(cè)體溫，已經(jīng)降至35℃。經(jīng)體表診查，眼角無(wú)結(jié)屎和流淚，四肢及腹下無(wú)明顯疹塊，口腔黏膜、舌和唇部無(wú)痂皮病變，肛門(mén)無(wú)結(jié)糞或拉稀等現(xiàn)象。

2 血樣采集

保定使獼猴側(cè)臥，無(wú)菌從心臟采集血液，靜置30 min，3 000r/m離心后，收集上層血清于1.5 mL離心管，凍存?zhèn)錂z。

3 剖檢

兩側(cè)肺臟病變不一致，左側(cè)肺臟輕微萎縮，右側(cè)肺尖葉有出血，輕度壞死，肌肉及皮下未見(jiàn)有出血點(diǎn)，腹股溝淺淋巴結(jié)無(wú)腫大和出血，肝、脾、腎未見(jiàn)異常，腸道粘膜無(wú)充血和出血，心包無(wú)積液，心肌未見(jiàn)出血點(diǎn)。無(wú)菌采淋巴結(jié)、脾、肺、肝臟等組織樣品送實(shí)驗(yàn)室作細(xì)菌分離培養(yǎng)。

4 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無(wú)菌取淋巴結(jié)、肝、脾、肺分別接種營(yíng)養(yǎng)肉湯和血瓊脂平皿培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，均未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。

5 猴三種主要病毒血清抗體檢測(cè)

5.1 設(shè)備、試劑和材料

5.1.1 設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱或水浴鍋、搖床、震蕩器、可調(diào)移液器、電子分析天平（精度0.1 mg）。

5.1.2 試劑 猴T淋巴細(xì)胞白血病病毒1型（STLV-1）斑點(diǎn)酶免疫檢測(cè)試劑盒、獼猴皰疹病毒I型（B病毒）斑點(diǎn)酶免疫檢測(cè)試劑盒、猴免疫缺陷病毒（SIV）斑點(diǎn)酶免疫檢測(cè)試劑盒，均由美國(guó)VRL實(shí)驗(yàn)室中國(guó)分公司生產(chǎn)。

5.1.3 待檢猴血清樣品。

5.2 實(shí)驗(yàn)操作

STLV-1、B病毒和SIV三種病毒抗體檢測(cè)分別按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)，主要操作程序如下。

5.2.1 血清稀釋 樣品和陰性、陽(yáng)性血清作1:5稀釋。

5.2.2 準(zhǔn)備膜 取出抗原膜，編號(hào)后加入15mL樣本稀釋液，置搖床上慢速搖動(dòng)，室溫封閉半小時(shí)，結(jié)束后PBS洗滌三次。

5.2.3 貼膜 用尖頭鑷子輕夾一片小濾紙條，將一端小心浸入樣品稀釋液中待紙條吸附上液體后提出液面，并將紙條在試管口輕刷1~2次，去掉多余的液體，然后貼覆在抗原膜上用吸水紙吸干鑷尖，再貼下一個(gè)樣本。

5.2.4 孵育 每張膜貼好后，于37℃孵育30 min。

5.2.5 洗滌 取出洗滌三次，每次5 min。

5.2.6 酶標(biāo)二抗 加入酶標(biāo)二抗于室溫孵育30 min。

5.2.7 洗滌 取出洗滌三次，最后一遍把液體盡可能控干。

5.2.8 顯色 取顯色劑A和顯色劑B，將兩種顯色劑混合倒入平皿中，待陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)出現(xiàn)明顯的紅色時(shí)即可終止反應(yīng)。

5.2.9 終止 將染好的膜放入預(yù)先準(zhǔn)備好的終止液中1 min，然后用蒸餾水快速洗滌兩遍。將膜置于空氣中自然晾干。

5.3 結(jié)果判定

5.3.1 陽(yáng)性結(jié)果判定 對(duì)照細(xì)胞點(diǎn)無(wú)色或顏色很淡，陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)呈紅色，若樣品病毒抗原點(diǎn)呈紅色，則判為陽(yáng)性。

5.3.2 陰性結(jié)果判定 對(duì)照細(xì)胞點(diǎn)無(wú)色或顏色很淡，陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)呈紅色，若樣品病毒抗原點(diǎn)無(wú)色，或顏色很淺且與相應(yīng)對(duì)照細(xì)胞點(diǎn)接近，則判為陰性。

5.4 檢測(cè)結(jié)果

分別用猴T淋巴細(xì)胞白血病病毒1型（STLV-1）、獼猴皰疹病毒I型（B病毒）和猴免疫缺陷病毒（SIV）斑點(diǎn)酶免疫檢測(cè)試劑盒檢測(cè)野生獼猴血清中STLV-1、B病毒和SIV抗體，猴血清中STLV-1和B病毒抗體呈陽(yáng)性，SIV抗體呈陰性。

6 小結(jié)

對(duì)廣西某自然保護(hù)區(qū)發(fā)病的野生獼猴進(jìn)行臨床檢查、剖檢、采集臟器作細(xì)菌分離培養(yǎng)、臨床檢查未見(jiàn)有特征性變化，剖檢僅見(jiàn)右側(cè)肺尖葉有出血，左側(cè)肺臟輕微萎縮外，其它臟器未見(jiàn)典型病變，從臟器組織也未分離出致病性細(xì)菌，初步排除細(xì)菌性傳染病。

經(jīng)檢測(cè)感染猴3種主要病毒性疾病的血清病毒抗體，猴T淋巴細(xì)胞白血病病毒1型（STLV-1）和獼猴皰疹病毒I型（B病毒）抗體均為陽(yáng)性，猴免疫缺陷病毒（SIV）為陰性。STLV-1屬于C型逆轉(zhuǎn)錄病毒，與非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的T淋巴白血病和淋巴腫瘤有關(guān)，其主要傳播方式是通過(guò)血液傳播[1]，可能與部分獼猴的惡性腫瘤有關(guān)。猴B病毒是獼猴皰疹病毒I型，獼猴感染B病毒后常無(wú)明顯的臨床癥狀，有些可引起牙齦炎、結(jié)膜炎和口腔及生殖器官感染，之后可轉(zhuǎn)為慢性感染。但在受到刺激，抵抗力下降或自發(fā)再激活時(shí)，可在唾液或生殖道分泌物中排毒。猴之間的傳播主要以密切接觸、抓咬和性活動(dòng)為主。同時(shí)，猴B病毒為人獸共患病，B病毒可以通過(guò)帶毒病猴咬傷而使人感染，被咬局部發(fā)生紅、腫、熱、痛、皰疹和淋巴管炎及淋巴結(jié)炎，最后出現(xiàn)上行性脊髓炎，因此防范B病毒的感染具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義[2-4]。

病猴血清中STLV-1和B病毒抗體為陽(yáng)性，說(shuō)明獼猴感染過(guò)這兩種病毒。由于條件有限，未能進(jìn)行結(jié)核病、流感病毒等其他更多的病原檢測(cè)，引起該獼猴死亡的原因是否是STLV-1或B病毒，有待進(jìn)一步證實(shí)。

[1] 張利仙，陳朝銀，艾軍，等.猴嗜T淋巴白血病病毒研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2011，38（2）：174-177.

[2] 張振興，沈永林.動(dòng)物園動(dòng)物疾病[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2009：245-246.

[3] 田克恭，藺會(huì)云，遇秀玲，等.PCR在猴B病毒鑒定中的應(yīng)用研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2001，9（4）：213-215.

[4] 堯黃印，翁玉麟.福建野生獼猴B病毒感染情況調(diào)查[J].畜牧獸醫(yī)雜志，1991（4）：15-16.