原發(fā)免疫性血小板減少癥患者外周血Th17細(xì)胞的檢測(cè)及意義

李秀芹 張虎田

（東海縣人民醫(yī)院血液科 江蘇 東海 222300）

原發(fā)免疫性血小板減少癥（ITP）亦稱特發(fā)性血小板減少性紫癜，是臨床常見的出血性疾病，屬于器官特異性自身免疫性疾病。ITP的發(fā)病機(jī)制未完全明了，傳統(tǒng)觀念認(rèn)為機(jī)體體液免疫異常，B細(xì)胞產(chǎn)生大量抗血小板抗體介導(dǎo)血小板在單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)被破壞。然而越來越多的研究表明細(xì)胞免疫異常亦參與ITP的發(fā)病機(jī)制[1]。T細(xì)胞主要分為CD4+、CD8+T細(xì)胞，CD4+/CD8+T細(xì)胞平衡對(duì)維持機(jī)體的免疫穩(wěn)定具有重要作用。Th17細(xì)胞是新發(fā)現(xiàn)的以高分泌IL-17為特征的CD4+T細(xì)胞亞群。研究表明Th17細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)性腦脊髓膜炎、變應(yīng)性膠原病及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮重要作用[2,3]。關(guān)于Th17細(xì)胞在ITP中作用研究甚少。因此本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)ITP患者外周血T細(xì)胞亞群、Th17細(xì)胞的百分率，初步闡明其在ITP發(fā)病機(jī)制中的作用。

1.資料和方法

1.1 研究對(duì)象

30例ITP患者均為2016年3月—2018年8月來我院血液科就診的住院和門診患者，其中男10例，女20例，中位年齡35歲（12歲～78歲），診斷均符合張之南的《血液病的診斷與療效標(biāo)準(zhǔn)》[4]。30例對(duì)照者為來我院體檢的健康者，男10例，女20例，中位年齡36歲（13歲～80歲）。所有ITP患者的血小板計(jì)數(shù)均＜30×109/L，均數(shù)為：（8.05±6.79）×109/L。健康對(duì)照者血小板計(jì)數(shù)在（100～300）×109/L，均數(shù)為：（176.43±64.52）×109/L。

1.2 標(biāo)本采集

所有ITP患者和對(duì)照者均空腹外周靜脈采血1ml，肝素抗凝。

1.3 主要試劑和儀器

Anti-CD4-FITC、Anti-CD3-PerCP、Anti-CD8-PE均購自美國(guó)BD公司，Anti-IL-17A-Alexa Fluor647（Anti-IL-17A-AF647）購自美國(guó)BioLegend公司，無酚紅RPMI1640培養(yǎng)基購自美國(guó)Gibco公司，PMA、BFA購自美國(guó)Invitrogen公司，Ionomycin購自美國(guó)Sigma公司，固定劑、破膜劑購自AN DER GRUB公司，溶血素購自美國(guó)BD公司，1×PBS緩沖液為本實(shí)驗(yàn)室自配，F(xiàn)ACS Calibur型流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.4 T細(xì)胞亞群檢測(cè)

取一流式管加入Anti-CD4-FITC/Anti-CD3-PerCP/Anti-CD8-PE各2μl，再加入外周血100μl，避光孵育20min，加入1ml溶血素，避光溶血5min，1×PBS 2ml洗滌，離心（2000r/min，2min），共2次，棄上清，加200μl PBS，上機(jī)檢測(cè)。

1.5 Th17細(xì)胞的檢測(cè)

取一EP管加入新鮮肝素抗凝血100μl，無酚紅RPMI1640培養(yǎng)基860μl混勻，再加入10μl PMA工作液，10μl Ionomycin工作液，20μl BFA工作液，體系中PMA、Ionomycin、BFA終質(zhì)量濃度分別為50ng/ml、750ng/ml、10μl/ml。在37℃水浴箱中培養(yǎng)3h；將培養(yǎng)后的細(xì)胞懸液輕輕混勻取600μl，加入1個(gè)流式管中，離心（2000r/min，2min）；棄上清，振蕩混勻，加入Anti-CD4-FITC 2μl，避光孵育15min；加100μl固定液，避光放置15min；加2ml 1×PBS洗滌，離心（2000r/min，2min）；棄上清，振蕩混勻，加100μl破膜劑，避免震蕩，輕輕混勻，避光5min；管中再加入2μl Anti-IL-17A-AF647，輕輕混勻，避光孵育15min；加2ml 1×PBS洗滌一次，離心（1500r/min，5min），棄上清，上機(jī)檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 ITP患者外周血T細(xì)胞亞群的分析

與健康對(duì)照組比較，ITP患者組CD3+T細(xì)胞百分率降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CD4+T細(xì)胞百分率、CD4+/CD8+T細(xì)胞比率降低（P＜0.05）；CD8+T細(xì)胞百分率升高（P＜0.05）。具體見表。

表 ITP患者外周血T細(xì)胞亞群的分析 （%,±s）

表 ITP患者外周血T細(xì)胞亞群的分析 （%,±s）

aP＜0.05 ITP組vs對(duì)照組。

組別 n CD3 CD4 CD8 CD4+/CD8+ITP 組 30 69.74±9.01 29.00±9.23a 34.18±9.45a 1.06±0.41a對(duì)照組 30 73.63±7.01 40.05±5.40 28.12±4.38 1.54±0.43

2.2 ITP患者外周血Th17細(xì)胞的百分率

ITP患者組的Th17細(xì)胞的百分率：（2.71±1.02）%，對(duì)照組Th17細(xì)胞的百分率：（2.01±0.48）%。ITP患者組的Th17細(xì)胞的百分率較對(duì)照組升高（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

圖1 Th17細(xì)胞的流式檢測(cè)分析

以CD4+T IL-17+界定為Th17細(xì)胞，即右上象限為Th17細(xì)胞百分率。a為健康對(duì)照者，b為ITP患者。

3.討論

ITP是一因血小板免疫性破壞，導(dǎo)致外周血中血小板減少的出血性疾病。其發(fā)病機(jī)制未完全明了，目前大量研究表明體液、細(xì)胞免疫異常均參與ITP的發(fā)病過程。T細(xì)胞主要分為CD4+和CD8+T細(xì)胞，CD4+/CD8+T細(xì)胞之間的平衡是維持機(jī)體免疫穩(wěn)定的中心環(huán)節(jié)。馮建軍等[5]研究發(fā)現(xiàn)ITP患者存在CD4+/CD8+T細(xì)胞比例失衡，提示T細(xì)胞亞群失調(diào)參與了ITP的發(fā)病過程。本實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)與對(duì)照組相比ITP患者組CD4+T細(xì)胞百分率減低，CD8+T細(xì)胞百分率升高，CD4+/CD8+T細(xì)胞比率降低。ITP患者存在CD4+/CD8+T細(xì)胞比例失調(diào)，T細(xì)胞亞群失衡參與了ITP的發(fā)病過程。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得ITP患者組CD3+T細(xì)胞百分率較對(duì)照組降低但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與馮建軍等研究報(bào)道不一致，其可能的原因有待于進(jìn)一步研究。

Th17細(xì)胞是2005年P(guān)ark[2]在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎和膠原蛋白誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎典型的自身免疫性動(dòng)物模型的研究中發(fā)現(xiàn)的不同于Th1、Th2細(xì)胞的CD4+T細(xì)胞亞群。Th17細(xì)胞是因特異性分泌IL-17而得名。IL-17具有促炎反應(yīng)作用。研究表明Th17細(xì)胞參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎癥性腸病等[3,6,7]自身免疫性疾病的發(fā)病過程。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得ITP患者組Th17細(xì)胞百分率較對(duì)照組升高。提示ITP患者體內(nèi)Th17細(xì)胞數(shù)量增多，分泌過多IL-17，通過IL-17參與ITP的發(fā)生、發(fā)展。因此Th17細(xì)胞百分率增高可能參與ITP的發(fā)病過程。

總之，本研究再次證實(shí)了ITP患者CD4+T細(xì)胞百分率降低，CD8+T細(xì)胞百分率升高，存在CD4+/CD8+T細(xì)胞比例失衡，細(xì)胞免疫異常參與ITP的發(fā)病過程。ITP患者Th17細(xì)胞百分率升高，通過對(duì)Th17細(xì)胞的深入研究有助于進(jìn)一步明確ITP的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療ITP提供新的靶點(diǎn)。