結(jié)核分枝桿菌thy A基因突變與對(duì)氨基水楊酸鈉耐藥關(guān)系的研究

孫勇 洪峰 許紹發(fā) 邢青 劉毅 任衛(wèi)聰 孫照剛 高鐵杰 張治國(guó) 易俊莉 王甦民 李傳友

目前，結(jié)核病仍是最常見(jiàn)的傳染病之一，全世界約有2億人感染Mtb，其中僅2010年新增880萬(wàn)患者，140萬(wàn)人死于結(jié)核?。?］。近年來(lái)，由于不合理的用藥及新藥研發(fā)的緩慢導(dǎo)致 MDR－TB（至少對(duì)INH、RFP耐藥的結(jié)核?。┗颊叩脑龆嗉敖Y(jié)核病防控的困難。2010年我國(guó)結(jié)核患者中有5.4%為MDR－TB患者［1］。由于Mtb對(duì)一線藥物的耐藥，人們開(kāi)始更多關(guān)注二線抗結(jié)核藥物，并與一線抗結(jié)核藥聯(lián)合應(yīng)用，但隨著應(yīng)用的二線藥物如氟喹諾酮類藥物、卡那霉素、卷曲霉素等耐藥出現(xiàn)，人們又開(kāi)始尋找那些對(duì)Mtb有抑制或殺滅作用而應(yīng)用不是很廣泛的藥物，其中對(duì)氨基水楊酸鈉（PAS）是重要的二線抗結(jié)核病藥物之一，但對(duì)其作用機(jī)制及耐藥機(jī)制尚不十分清楚。

PAS對(duì)Mtb有抑制作用，一般認(rèn)為PAS與對(duì)氨基苯甲酸（PABA）近似，通過(guò)對(duì)葉酸合成的競(jìng)爭(zhēng)抑制作用而抑制 Mtb的生長(zhǎng)繁殖［2］。Rengarajan等［2］在卡介苗菌株中利用轉(zhuǎn)座子插入的方法，發(fā)現(xiàn)編碼胸苷酸合成酶 （thymidylate synthase，thy A）的基因突變抑制了酶的活性導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)葉酸水平的下降，其認(rèn)為thy A基因突變不僅導(dǎo)致PAS耐藥而且還是其他和葉酸代謝相關(guān)藥物的靶點(diǎn)。Ratledge等［3］認(rèn)為PAS抑制了 Mtb對(duì)鐵離子的吸收，從而導(dǎo)致Mtb生長(zhǎng)受限及毒力的減弱。由于PAS不是臨床首選藥，應(yīng)用的相對(duì)較少，對(duì)其耐藥的研究更少，目前認(rèn)為thy A基因的突變導(dǎo)致了PAS耐藥［2］。筆者通過(guò)全基因測(cè)序測(cè)定thy A基因，了解65株P(guān)AS敏感菌株和31株P(guān)AS耐藥菌株thy A基因突變情況，分析了PAS耐藥與thy A基因突變的關(guān)系，探討PAS耐藥分子機(jī)制，為建立快速耐藥檢測(cè)方法及指導(dǎo)臨床醫(yī)生合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

材料和方法

一、材料

1.臨床菌株來(lái)源：本實(shí)驗(yàn)所用北京地區(qū)96株Mtb臨床分離株來(lái)源于2008—2010年北京市結(jié)核病控制研究所和北京市昌平區(qū)結(jié)核病防治所，采集的痰標(biāo)本按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》［4］進(jìn)行Mtb的培養(yǎng)、菌種鑒定，采用比例法測(cè)定藥物敏感實(shí)驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv（ATCC25618）為本室保存。

2.主要儀器設(shè)備：Bio－rad S1000基因擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio－rad公司），F(xiàn)o ToDYNE凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Image公司），Nanodrop2000核酸分析儀（美國(guó)Thermo公司），ESCOⅡ生物安全柜（新加坡ESCO公司）。

二、方法

1.細(xì)菌基因組DNA的抽提：采用酚/氯仿抽提的方法［5］。

2.PCR 擴(kuò)增：Primier 5.0設(shè)計(jì)引物，上游5′GGTGTCGGTGGTTTTCGGCAT3′， 下 游 5′TCAGCCCCACCATCGTCACAC3′，擴(kuò) 增 全 長(zhǎng)1060 bp，其中包含thy A基因（792 bp）。采用50μl體系，包括2×pfu DNA聚合酶（北京Generay公司）25μl，上下游引物各0.4μmol/L，1μl模板，雙蒸水22μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，62℃退火40 s，72℃延伸2.3 min，最后72℃延伸5 min，35個(gè)循環(huán)。

3.PCR純化：PCR產(chǎn)物置1%瓊脂糖凝膠中電泳，用DNA凝膠回收試劑盒（杭州Axygen公司）回收DNA擴(kuò)增片段，分別送北京擎科新業(yè)和北京金唯智生物科技公司測(cè)序。H37Rv的標(biāo)準(zhǔn)序列來(lái)自結(jié) 核 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 網(wǎng) 站［6］。 采 用 DNAMAN Version 5.2.2軟件進(jìn)行序列比對(duì)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Mtb培養(yǎng)、鑒定及藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分離得到96株痰培養(yǎng)陽(yáng)性菌株并進(jìn)行鑒定和藥物敏感性實(shí)驗(yàn)。全部鑒定為Mtb，耐PAS菌株31株（32.29%），敏感菌株65株（67.71%），耐藥與敏感菌株的患者男性與女性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.381，P＞0.05）；初治患者中耐藥與敏感菌株分別達(dá)到了70.97%、86.15%，但兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝3.177，P＞0.05）；同時(shí)北京常駐人口與外地流動(dòng)人員相比較耐藥與敏感菌株差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.037，P＞0.05）（表1）。

表1 96株Mtb對(duì)PAS的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ［株（構(gòu)成比，%）］

二、PCR擴(kuò)增結(jié)果

96株Mtb經(jīng)PCR擴(kuò)增，在1000 bp左右均擴(kuò)增出清晰條帶，部分結(jié)果見(jiàn)圖1。經(jīng)凝膠回收對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，經(jīng)測(cè)序比對(duì)后證實(shí)包含thy A基因片段。

圖1 thy A基因擴(kuò)增片段電泳結(jié)果

三、序列測(cè)定的分析結(jié)果

以Mtb標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv序列為對(duì)照對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)突變類型包括單堿基缺失、堿基的插入、堿基突變。其中以第19位堿基C缺失和第168位堿基C缺失突變?yōu)橹?，在耐藥菌株中的突變率分別是54.84%（17/31）、25.81%（8/31，包括聯(lián)合其他位點(diǎn)突變株），但其敏感菌株中突變也達(dá)了35.39%（23/65），12.31%（8/65），耐藥與敏感相比兩個(gè)位點(diǎn)突變差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝3.268、2.754，P＞0.05）。在31株P(guān)AS耐藥菌株中19位缺失C單突變9株、其聯(lián)合168位缺失C突變4株，168位缺失C單突變2株，此外188位缺失T突變2株，5株多位點(diǎn)突變均為1株，其余9株（29.03%）耐PAS菌株thy A基因未發(fā)生突變；敏感菌中19位缺失C突變最多15株，其聯(lián)合168位缺失C突變4株、聯(lián)合16位缺失G突變2株、聯(lián)合16位缺失G和168位缺失C突變2株，其余突變各1株，此外，PAS敏感菌株中有30株（46.15%）thy A基因發(fā)生突變（表2）。

討 論

PAS是最早被使用的抗結(jié)核藥之一［7］。盡管發(fā)現(xiàn)其對(duì)Mtb有抑菌作用，但因其具有腸道不良反應(yīng)及肝腎損傷，應(yīng)用的不是很廣泛，并沒(méi)有列入常規(guī)化療藥物。但隨著大量MDR－TB及常規(guī)使用的二線藥物的耐藥出現(xiàn)，PAS又重新被使用。PAS的研究很少，對(duì)PAS耐藥的研究更少。Rengarajan等［2］利用轉(zhuǎn)座子插入的方法在卡介苗中證實(shí)了PAS的耐藥和基因thy A的突變有關(guān)，隨后他們?cè)?株P(guān)AS耐藥臨床菌株中發(fā)現(xiàn)有3株菌thy A基因發(fā)生突變，其中2株第202位的蘇氨酸被丙氨酸替換（T202A）、1株第222位精氨酸置換為甘氨酸（R222G），而10株敏感菌株沒(méi)有突變。Mathys等［8］隨后分析了118株Mtb與葉酸代謝相關(guān)的6個(gè)基因thy A、dfr A、fol C、fol P1、fol P2、thy X 和 N－乙?；D(zhuǎn)移酶相關(guān)的3個(gè)基因nho A、aac（1）、aac（2），他們研究表明dfr A、fol P1、fol P2、thy X 基因的突變和PAS耐藥無(wú)關(guān)，而fol C、nho A、aac（1）、aac（2）4個(gè)基因沒(méi)有發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)，僅thy A基因突變導(dǎo)致了PAS耐藥。其中37%PAS耐藥菌株thy A基因發(fā)生了突變，主要的突變位點(diǎn)是T202A。

表2 31株P(guān)AS耐藥菌株和65株P(guān)AS敏感菌株thy A基因突變情況 ［株（構(gòu)成比，%）］

本研究中經(jīng)培養(yǎng)、藥敏實(shí)驗(yàn)鑒定的31例PAS耐藥菌株和65例PAS敏感菌株，在性別、治療情況、地域上差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中患者主要以男性初治患者居多，北京市戶籍人口和流動(dòng)人口患者基本持平。針對(duì)其thy A基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，有22（70.97%）株耐藥菌株thy A基因發(fā)生突變，而敏感菌株中也有30（46.15%）株突變，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝5.206，P＜0.05）。而突變主要以19位缺失C、168位缺失C為主，但敏感菌株和耐藥菌株之間差異卻沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示突變位點(diǎn)可能是thy A基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)，突變位點(diǎn)可能與PAS耐藥無(wú)關(guān)。本研究的thy A基因SNP位點(diǎn)與之前研究［8－9］并不吻合，表明thy A 基因突變的復(fù)雜多變。而此前認(rèn)為突變熱點(diǎn)的T202A［8］，本研究并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。因地域或菌株表型的差異，可能其thy A基因突變位點(diǎn)也不同。Feuerriegel等［10］也認(rèn)為thy A基因T202A突變位點(diǎn)并不是PAS耐藥標(biāo)志，可能是拉美地中海型菌株特異性突變位點(diǎn)。

本研究數(shù)據(jù)顯示PAS耐藥菌株與敏感菌株thy A基因突變位點(diǎn)差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PAS耐藥菌株中高達(dá)70.97%的菌株發(fā)生了thy A基因突變，因此thy A基因突變可能PAS耐藥的靶點(diǎn)，但本研究中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特異性的耐藥突變位點(diǎn)。此前國(guó)內(nèi)張宗德等［9］研究也發(fā)現(xiàn)thy A基因突變位點(diǎn)比較分散，沒(méi)有突變熱點(diǎn)，因此thy A基因突變是否與PAS耐藥相關(guān)一直是研究的熱點(diǎn)之一。國(guó)外的體外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了基因thy A的突變和PAS的耐藥相 關(guān)［2］。Fivian－Hughes 等［11］在 體 內(nèi) 研 究 證 實(shí)thy X基因同樣編碼胸苷酸合成酶，在thy A基因敲除菌中，胸苷酸合成酶活性沒(méi)有降低Mtb生長(zhǎng)并未受影響，推測(cè)是thy X基因編碼胸苷酸合成酶使其保持正常的水平。他們的研究還表明thy A基因的缺失和PAS的耐藥相關(guān)。Ulmer等［12］和 Hunter等［13］研究表明thy A、thy X基因可能是潛在的藥物靶點(diǎn)。而Rengarajan等［2］認(rèn)為thy X基因突變并沒(méi)有導(dǎo)致PAS耐藥。不同的研究顯示thy A或thy X基因均可能與PAS耐藥相關(guān)。

本研究分析了北京地區(qū)的31株P(guān)AS耐藥菌株和65株P(guān)AS敏感菌株thy A基因突變情況，耐藥和敏感菌株thy A基因的突變比例較高，但并沒(méi)發(fā)現(xiàn)與PAS耐藥相關(guān)的特異性位點(diǎn)，可能與所選樣本較少有關(guān)，也可能存在其他耐藥機(jī)制，因此還需進(jìn)一步大樣本的深入研究。研究thy A基因與PAS耐藥的關(guān)系，不僅能研究PAS耐藥機(jī)制、更好地指導(dǎo)臨床用藥，而且有助于建立快速、準(zhǔn)確的耐藥分子鑒定方法。

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