同時檢測逍遙丸中芍藥苷和槲皮素的含量研究

蘇蘭宜，肖慶青

（江西省醫(yī)藥學(xué)校，江西 南昌 330020）

逍遙丸是經(jīng)現(xiàn)代制劑工藝改進而成的逍遙散制劑，該方由柴胡、白芍等八味中藥組成，方中柴胡為君藥，白芍為臣藥。2010版《中國藥典》中逍遙丸以測定芍藥苷的含量作為制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)［1］，而國家部頒標(biāo)準(zhǔn)中僅有當(dāng)歸和白芍的鑒別反應(yīng)［2］，目前也有報道以甘草和柴胡的鑒別反應(yīng)結(jié)合HPLC法測定芍藥苷的含量［3］以控制逍遙丸的質(zhì)量。而將槲皮素也作為逍遙丸制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)尚未見報道。為了有效全面地控制逍遙丸的質(zhì)量，本研究建立了同時測定逍遙丸中芍藥苷和槲皮素含量的RP－HPLC法，旨在為該制劑提供一種簡便、快速、更有效的質(zhì)控方法。

1 儀器與試藥

Agilent1200液相色譜儀（美國），包括：G1315ADAD檢測器、四元梯度泵、柱溫箱；梅特勒 AL104電子分析天平；SK3300H型雙頻數(shù)顯超聲機（上海科導(dǎo)），SIGMA3－16K高速冷凍離心機（德國）。逍遙丸（湖北瑞華制藥有限責(zé)任公司），藥材均購自黃慶仁大藥房，柴胡（20100803）、白芍（20100920）、當(dāng)歸（20110321）、茯苓（20110215）、白術(shù)（炒）（20101024）、薄荷（20110921）、炙甘草（20110714）經(jīng)中藥鑒定教研室鑒定符合2010版《中國藥典》規(guī)定。對照品：芍藥苷（批號：110736－200829），槲皮素（批號：100081－201107）均購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈（色譜級），流動相用水為雙蒸水（自制）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

菲羅門 Luna－C18柱（250mm ×4.6mm，5μm）；流動相為：乙腈－0.1% 磷酸水，梯度洗脫；柱溫為30℃；DAD檢測器，檢測波長：230nm（芍藥苷）、254nm（槲皮素），進樣量均為20μL。

表1 流動相梯度

2.2 混合對照品溶液的配制

稱取芍藥苷、槲皮素對照品適量，精密稱定，置10mL容量瓶中，加甲醇制成1mL含芍藥苷 70.26μg、槲皮素25.23μg的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取逍遙丸10丸干燥，粉碎磨成粉末。取0.25g，精確稱定，置10mL玻璃離心管中，加甲醇8mL，超聲提取30min，共3次。合并提取液，冷卻，3000rpm離心10min，上清液轉(zhuǎn)入25mL容積瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，0.22μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備

按逍遙丸的1／10處方比例和制備工藝分別制備缺白芍和柴胡的逍遙丸，按供試品制備方法制備2種陰性對照溶液，按色譜條件測定，結(jié)果陰性對照樣品對測定無干擾。（見圖1、圖2）。

2.5 測定方法

分別吸取陰性對照溶液、混合對照品溶液、供試品溶液，按上述色譜條件進樣，記錄峰面積。

圖1 缺白芍陰性樣品（S1）、供試品（S2）和混合對照品（S3）在230nm處HPLC色譜

2.6 線性關(guān)系

分別準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2mL置2mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得系列不同濃度的混合對照品溶液。分別吸取上述系列濃度對照品溶液20μL，注入色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積（Y）對濃度（X，μg／mL）進行線性回歸，得回歸方程（見表2）。

2.7 精密度

精密吸取濃度為42.16μg／mL芍藥苷、15.14μg／mL槲皮素混合照品溶液20μL，重復(fù)進樣6次，按色譜條件測定峰面積值。求得日內(nèi)RSD值，芍藥苷為1.4%，槲皮素為1.95%，連續(xù)分析3天；求得日間RSD值，芍藥苷為0.20%，槲皮素為1.62%。

圖2 缺柴胡陰性樣品（S1）、供試品（S2）和混合對照品（S3）在254nm處HPLC色譜

表2 線性關(guān)系（n＝6）

2.8 穩(wěn)定性

取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12h進樣1次，測定峰面積。結(jié)果芍藥苷的RSD為1.74%（n＝7），槲皮素的RSD為1.85%（n＝7），表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性

取同一批樣品（批號：20070501）6份，按“2.3”項下供試品溶液制備方法制備，依法測定計算各物質(zhì)含量。結(jié)果芍藥苷的RSD值為0.43%，槲皮素的RSD為1.47%。

2.10 加樣回收率試驗

取已知含量的供試品粉末（含芍藥苷3.254mg／g、槲皮素0.803mg／g）混勻，平行6份，每份重約0.25g，精密稱定，分別精密加入濃度為813.51μg／mL的芍藥苷、200.75μg／mL槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0mL，按“2.3”項下供試品溶液制備方法制備，按色譜條件測定，計算平均回收率，結(jié)果見表3。

2.11 樣品測定

按供試品制備方法制備樣品溶液3份，按色譜條件測定，計算含量，結(jié)果見表4。

3 討論

本研究比較了不同比例的乙醇、甲醇、水的提取溶媒，確定了甲醇為最佳提取溶媒；又進一步考查了回流、超聲提取的兩種提取效果，結(jié)果以甲醇為溶媒，超聲提取效果較好，之后優(yōu)化了超聲提取方法，確定超聲提取3次，每次30 min，可較好除去干擾雜質(zhì)又可提取完全，效果最佳。

本研究考察了乙腈－水、乙腈－磷酸溶液、乙腈－醋酸溶液、甲醇－磷酸溶液、甲醇－水等流動相系統(tǒng)，最終以乙腈－0.1%磷酸溶液作為流動相系統(tǒng)，采用梯度洗脫，待分析物與雜質(zhì)能達到基線分離，峰形較好，理論塔板數(shù)高，分離效果最好。實驗中還發(fā)現(xiàn)柱溫在30℃ 時比25℃ 時的分離效果更好。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）

表4 逍遙丸中芍藥苷、槲皮素的含量（n＝3）

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.北京：北京化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

［2］于國平，張蓮萍，李秋怡，等.逍遙丸（濃縮丸）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2006，17（8）：1493－1494.

［3］祁海宏，鄔瑾麗，項樂源，等.逍遙濃縮丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立［J］.中國臨床藥學(xué)雜志，2008，17（3）：179－181.