柘木鎮(zhèn)痛消炎作用實(shí)驗(yàn)研究

李京才 鐘 成

(廣東省中醫(yī)院制劑室，廣東 廣州 510370)

柘木為?？浦参顲udrania tricuspidata(Carr.)Bur柘樹的木部，又名柘桑、刺釘、黃疸樹等，廣泛分布于我國(guó)華東、華南等地區(qū)［1］。從柘木中分離鑒定的化學(xué)成分主要有xanthone類和黃酮類兩大類成分以及其他成分［2］。近年研究表明，柘木具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗結(jié)核、抗乙型肝炎病毒表面抗原活性、抗高血壓病、抗腦缺血再灌注損傷、保護(hù)肝臟及缺血后神經(jīng)細(xì)胞等作用［1－3］。近幾年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)柘木的藥理作用研究較多，發(fā)現(xiàn)柘木還有一定的鎮(zhèn)痛消炎作用［4－6］，但研究不太深入。傳統(tǒng)藥理實(shí)驗(yàn)理論中經(jīng)典鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)是采用扭體法和熱板法來(lái)考察小鼠的扭體潛伏期，以扭體出現(xiàn)次數(shù)和痛閥值來(lái)衡量鎮(zhèn)痛作用效果;抗炎作用實(shí)驗(yàn)則是通過(guò)觀察藥物對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性及藥物致小鼠腫脹作用來(lái)反應(yīng)效果，本研究采取以上方法觀察柘木的鎮(zhèn)痛消炎作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠120只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)0055669，廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院普通級(jí)動(dòng)物室飼養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 柘木樣品(膏劑，廣東羅浮山藥業(yè)有限公司，批號(hào)110109)，吲哚美辛腸溶片(廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H44020701，批號(hào)110501)，羅通定片(廣東九連山藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J55020702，批號(hào) 101224)。二甲苯(廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)20101204)，乙酸(廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)20101204)，1%伊文思蘭生理鹽水液(廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)20101217)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 UNI C07200型光柵分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司生產(chǎn);BS 11OS型電子天平，Sartorius公司生產(chǎn);YLS－6B智能熱板儀、打孔器，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站生產(chǎn);TP2310型離心機(jī)，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)醋酸致扭體小鼠的影響［7］取小鼠30只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，分別為空白對(duì)照組、羅通定組及柘木高、中、低劑量組，每組各6只。柘木高、中、低劑量組分別予柘木混懸液［柘木膏劑研磨，加蒸餾水20 mL/(kg·d)］375、250、125 mg/(kg·d)灌胃［分別相當(dāng)于成人用量的30、20、10倍。以成人60 kg體質(zhì)量計(jì)算，服用劑量為12.5 mg(kg·d)］，羅通定組予羅通定混懸液［羅通定片研成粉狀，加蒸餾水20 mL/(kg·d)］60 mg/(kg·d)［相當(dāng)于成人用量的20倍。以成人60 kg體質(zhì)量計(jì)算，服用劑量為3 mg/(kg·d)］灌胃，空白對(duì)照組予等容積蒸餾水灌胃，均每日1次，連續(xù)6 d。末次給藥后40 min各組均予0.6%醋酸0.2 mL/只腹腔注射。觀察10 min內(nèi)小鼠出現(xiàn)扭體(包括腹部?jī)?nèi)凹、伸展后肢及臀部抬高)次數(shù)及扭體潛伏期。

1.2.2 對(duì)熱板法刺激性疼痛小鼠的影響［7－8］取小鼠30只，雌雄各半，于55℃ YLS－6B智能熱板儀金屬板上，以各鼠自放在金屬板上至出現(xiàn)舔足所需時(shí)間(s)作為該小鼠的空白痛閾值，舔足時(shí)間＜5 s(反應(yīng)過(guò)敏)或＞30 s(反應(yīng)遲鈍)或跳躍者為不合格，排除實(shí)驗(yàn)。取合格小鼠30只，隨機(jī)分為5組，分組及給藥方法、劑量同1.2.1項(xiàng)。末次給藥60 min后將各組小鼠放在55℃恒溫金屬板上，測(cè)量其第1次舔足時(shí)間，30 s仍無(wú)反應(yīng)者，將小鼠取出以免燙傷，其痛閾值以30 s計(jì)。計(jì)算各組小鼠痛閾值。

1.2.3 對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響［9］取小鼠30只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，分別為空白對(duì)照組、吲哚美辛組及柘木高、中、低劑量組，每組各6只。柘木高、中、低劑量組及空白對(duì)照組給藥方法、劑量同1.2.1項(xiàng)，吲哚美辛組予吲哚美辛混懸液［吲哚美辛研成粉狀，加蒸餾水20 mL/(kg·d)］12.5 mg/(kg·d)［相當(dāng)于成人用量 10倍。以成人60 kg體質(zhì)量計(jì)算，服用劑量為1.25 mg(kg·d)］，每日1次，連續(xù)6 d。末次給藥后30 min予1%伊文思蘭生理鹽水液10 mL/kg尾靜脈注射后，隨即予0.6%醋酸0.2 mL/只腹腔注射。20 min后處死各組小鼠，剪開腹腔，用0.9%氯化鈉注射液5 mL沖洗腹腔數(shù)次收集洗滌液，1 000 r/min，離心5 min，取上清液，用光柵分光光度計(jì)在590 nm處比色測(cè)各組吸光度(OD)值。

1.2.4 對(duì)二甲苯致耳腫脹小鼠的影響［7－10］取小鼠30只，雌雄各半，分組及給藥方法、劑量同1.2.3項(xiàng)。末次給藥后30 min將二甲苯0.5 mL滴于各組小鼠右耳，左耳作對(duì)照。20 min后將各組小鼠頸部脫臼處死，用打孔器分別于左、右耳同一部位打下同等大小圓耳片，稱定質(zhì)量，以右圓耳片質(zhì)量－左圓耳片質(zhì)量之差作為腫脹度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠扭體次數(shù)及潛伏期比較 見表1。

表1 各組小鼠扭體次數(shù)及潛伏期比較±s

表1 各組小鼠扭體次數(shù)及潛伏期比較±s

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與羅痛定組比較，△P＜0.01;與柘木高劑量組比較，#P ＜0.05

組 別 n 扭體次數(shù)(次/min) 扭體潛伏期(min)空白對(duì)照組 6 14±65.33±1.41羅通定組 6 5±2＊＊ 7.11±1.26＊＊柘木高劑量組 6 8±4＊＊△ 7.43±2.31*柘木中劑量組 6 9±3＊△ 5.90±1.77#柘木低劑量組 6 9±5＊△5.96±2.28

由表1可見，羅通定組及柘木高、中、低劑量組小鼠扭體次數(shù)與空白對(duì)照組比較均明顯減少(P＜0.01，P＜0.05)，羅通定組扭體次數(shù)少于柘木高、中、低劑量組(P＜0.01)。羅通定組及柘木高劑量組扭體潛伏期均較空白對(duì)照組延長(zhǎng)(P ＜0.01，P ＜0.05)，且柘木高劑量與中劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 各組小鼠痛閾值比較 見表2。

表2 各組小鼠痛閾值比較s，±s

表2 各組小鼠痛閾值比較s，±s

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與羅痛定組比較，△P ＜0.05

組 別 n 痛閾值空白對(duì)照組610.51±2.26羅通定組 6 23.81±5.31＊＊柘木高劑量組 6 16.15±4.07＊＊△柘木中劑量組 6 16.63±5.89＊△柘木低劑量組 6 14.24±6.41△

由表2可見，羅通定組及柘木高、中劑量組小鼠痛閾值與空白對(duì)照組比較均明顯提高(P＜0.01，P＜0.05)。羅通定組痛閾值均高于柘木高、中、低劑量組(P＜0.05)。

2.3 各組小鼠OD值比較 見表3。

表3 各組小鼠OD值比較±s

表3 各組小鼠OD值比較±s

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與吲哚美辛組比較，△P ＜0.05

組 別 n OD值空白對(duì)照組61.464±0.166吲哚美辛組 6 0.361±0.163＊＊柘木高劑量組 6 1.115±0.311＊△柘木中劑量組 6 1.116±0.176＊＊△柘木低劑量組 6 1.075±0.226＊△

由表3可見，吲哚辛組及柘木高、中、低劑量組OD值與空白對(duì)照組比較均明顯降低(P＜0.01，P＜0.05)，且吲哚美辛組低于柘木高、中、低劑量組(P＜0.05)。

2.4 各組小鼠耳腫脹度比較 見表4。

表4 各組小鼠耳腫脹度比較mg，±s

表4 各組小鼠耳腫脹度比較mg，±s

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05

組 別 n 耳腫脹度空白對(duì)照組63.720 0±1.461 4吲哚美辛組 6 2.040 0±1.714 8*柘木高劑量組 6 2.450 0±1.163 8柘木中劑量組 6 3.460 0±1.079 1柘木低劑量組63.380 0±1.794 9

由表4可見，吲哚美辛組耳腫脹度與空白對(duì)照組比較明顯下降(P＜0.05)，柘木高、中、低劑量組與空白對(duì)照組比較有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

疼痛是一種令人不快的感覺和情緒上的主觀感受，伴有現(xiàn)存的和潛在的組織損傷。實(shí)驗(yàn)常用化學(xué)刺激法、熱刺激法制造疼痛模型動(dòng)物來(lái)觀察藥物的鎮(zhèn)痛作用。炎癥是機(jī)體對(duì)于刺激的一種防御反應(yīng)，表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛和功能障礙。實(shí)驗(yàn)常用物理、化學(xué)刺激法制造炎癥動(dòng)物模型來(lái)觀察藥物的抗炎作用，如外傷、高溫、低溫、紫外線或二甲苯、角叉菜膠等化學(xué)藥物致炎。本實(shí)驗(yàn)以醋酸等刺激性液體注入小鼠體內(nèi)，刺激小鼠腹膜引起膜腔深部大面積持久的疼痛，并引起小鼠“扭體”反應(yīng)，以藥物減少小鼠扭體反應(yīng)的次數(shù)及扭體潛伏期作為鎮(zhèn)痛指標(biāo);在熱板法實(shí)驗(yàn)中將小鼠置于恒溫板上，熱刺激小鼠足部產(chǎn)生疼痛反應(yīng)，以其舔后足作為疼痛反應(yīng)指標(biāo)，觀察小鼠開始出現(xiàn)疼痛反應(yīng)的時(shí)間作為小鼠痛閾值，比較各組間痛閾值的差異，判斷藥物有無(wú)鎮(zhèn)痛作用;在毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)中，采用不同的致炎因素，引起局部炎癥反應(yīng)，然后靜脈給予特殊染料測(cè)定染料的通透量，根據(jù)炎癥部位著色的深淺，反映毛細(xì)血管通透性，如果藥物可減少炎癥部位著色的通透量，降低OD值，則證明有作用;在耳腫脹實(shí)驗(yàn)中以二甲苯刺激耳廓皮膚黏膜致急性炎癥，使小鼠耳廓腫脹，耳質(zhì)量增加，若藥物可以抑制這種致炎劑引起的耳質(zhì)量增加，即可了解此藥物的抗炎消腫作用。以上實(shí)驗(yàn)觀察方法簡(jiǎn)單明了，快速，耗藥量少，易于操作，結(jié)果準(zhǔn)確性高。

羅通定是非麻醉性鎮(zhèn)痛藥，在鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗缺血再灌注損傷、降血壓、保肝及逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性等方面有較強(qiáng)活性，而抗炎作用弱［11－12］。因此，在本組實(shí)驗(yàn)的醋酸致扭體和熱板法2種疼痛模型中，參照文獻(xiàn)［11，13］以羅通定作為對(duì)照藥。吲哚美辛是吲哚類非甾體抗炎藥［14］，在本組實(shí)驗(yàn)的腹腔毛細(xì)血管通透性和耳廓腫脹2種炎癥模型中，參照文獻(xiàn)［10，15］以吲哚美辛作為對(duì)照藥。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“不通則痛，通則不痛”，說(shuō)明疼痛的產(chǎn)生系因多種因素，導(dǎo)致氣血不通而致。且不同的致病因素，導(dǎo)致的疼痛也不盡相同，如體內(nèi)有瘀血或風(fēng)濕等，則痛如針刺，部位固定或肢體麻木。炎癥由于致病因素、疾病表現(xiàn)階段及臟腑、部位的不同而有多種證型，需要選擇不同的藥物進(jìn)行治療，但多是通過(guò)清熱、解毒發(fā)揮作用。柘木主要功效為活血化瘀，舒經(jīng)活絡(luò)，清熱解毒，在臨床上可辨證應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，柘木可明顯減少醋酸致小鼠疼痛扭體次數(shù)，延長(zhǎng)扭體潛伏期，提高熱板刺激小鼠痛閾值，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用;抑制炎癥小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性，從而發(fā)揮抗炎機(jī)制。且柘木具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，而抗炎作用較弱。另外，該實(shí)驗(yàn)中藥呈非量效關(guān)系作用，其中250 mg/(kg·d)的效應(yīng)常較375 mg/(kg·d)更強(qiáng)，可能是與藥物作用的平臺(tái)效應(yīng)有關(guān)。

［1］張國(guó)明，徐曉英，奚靜芳.柘木化學(xué)成分研究［J］.中成藥，2008，30(5):771－773.

［2］姜琳，翟延君，李正言.柘木研究概述［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，11(4):55－57.

［3］杜立，張國(guó)明.柘木研究進(jìn)展［J］.中國(guó)現(xiàn)代中藥，2007，9(5):27－30，43.

［4］陳良兒，謝振家.柘樹莖乙醇提取液的抗炎鎮(zhèn)痛作用［J］.南京軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，24(1):11－13.

［5］Zheng ZP，Zhu Q，F(xiàn)an CL，et al.Phenolic tyrosinase inhibitors from the stems of Cudrania cochinchinensis［J］.Food Funct，2011，2(5):259－264.

［6］Chiou WF，Chen CC，Lin IH，et al.1，3，5－trihydroxy－4－prenylxanthone represses lipopolysaccharide－induced iNOS expression via impeding posttranslational modification of IRAK－1［J］.Biochem Pharmacol，2011，81(6):752－760.

［7］胡延，楊光義，葉方，等.蓖麻子不同炮制品抗炎鎮(zhèn)痛作用比較［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，31(21):1828－1829.

［8］馮潔，周勁帆，覃富景，等.兩面針根和莖抗炎鎮(zhèn)痛不同部位活性比較研究［J］.中藥藥理與臨床，2011，27(6):60－63.

［9］韋健全，羅瑩，黃健，等.穿破石抗炎鎮(zhèn)痛活性觀察及最大給藥量測(cè)定［J］.中成藥，2011，33(9):1589－1592.

［10］楊桂明，艾丹.白鮮皮抗炎有效部位的研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21(9):2209－2210.

［11］王云嬌，李武毅，張永云.羅通定片鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中藥材，2006，29(7):713－714.

［12］杜遠(yuǎn)東，趙玉珍.羅通定的藥理作用和臨床應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.西北藥學(xué)雜志，2012，27(1):91－94.

［13］王衛(wèi)華，董曉輝，劉衛(wèi)東，等.熱板法觀察度冷丁與羅通定的鎮(zhèn)痛作用［J］.菏澤醫(yī)學(xué)專科學(xué)校學(xué)報(bào)，2011，23(1):19－20.

［14］姚向超，鄧杏靈.非甾體類抗炎藥在眼科中的應(yīng)用研究分析［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南，2011，9(35):303－304.

［15］趙建軍.自制痛風(fēng)舒片對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物炎癥及疼痛的影響［J］.中國(guó)藥業(yè)，2010，19(21):16－17.