Transwell技術(shù)模擬人類免疫缺陷病毒感染黏膜及其他屏障系統(tǒng)的應(yīng)用

林光正，裘佳寅，劉叔文，李琳

1. 南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510515； 2. 南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510515

性傳播是目前人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)傳播的最主要方式，而生殖道及直腸黏膜感染是HIV性傳播的主要途徑。生殖道及直腸黏膜是機體抵抗HIV感染的第1道屏障，此外尚有許多其他屏障系統(tǒng)可抵御HIV在機體內(nèi)播散，如血-腦屏障及血-視網(wǎng)膜屏障等。但目前HIV感染黏膜及穿透機體自身屏障系統(tǒng)的具體機制尚不明確，HIV黏膜及屏障系統(tǒng)感染的模擬性實驗研究也存在許多局限性。Transwell技術(shù)可在體外模擬HIV感染機體黏膜及生物屏障系統(tǒng)，使HIV感染機制的研究能深入展開，在某種程度上能解決上述難題，也為HIV黏膜保護疫苗和藥物的研發(fā)尋找新的作用靶點。

1 Transwell技術(shù)概述

Transwell技術(shù)是目前細(xì)胞生物學(xué)中常用的實驗方法之一，在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域有著極其廣泛的應(yīng)用。Transwell小室(Transwell insert)底部是一張具有通透性的膜，一般為聚碳酸酯膜(polycarbonate member)，孔徑為0.1～12.0 μm，該膜體系能滿足細(xì)胞在膜內(nèi)正常生長、繁殖(圖1)。通常將Transwell小室放入細(xì)胞培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室(apical chamber)，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室(basolateral chamber)。應(yīng)用不同孔徑和不同處理的聚碳酸酯膜，可進行細(xì)胞共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多方面的研究。Transwell技術(shù)主要是根據(jù)不同實驗需求模擬機體生物屏障，以簡單、經(jīng)濟的手段模擬生物體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，在免疫學(xué)、藥理學(xué)、藥劑學(xué)等領(lǐng)域均發(fā)揮重要作用，尤其是在抗腫瘤研究中起非常重要的作用。目前，研究較多且相對較成熟的生物屏障模擬系統(tǒng)包括血-腦屏障、腸黏膜屏障、血-視網(wǎng)膜屏障、胎盤屏障和腹膜透析屏障等。

圖1 Transwell小室示意圖Fig.1 Transwell insert

2 Transwell技術(shù)模擬HIV黏膜感染模型的建立

目前，性傳播已成為HIV傳播的最主要途徑。在性交過程中，HIV感染者體液中的病毒極易透過生殖器黏膜屏障或直腸屏障進入未感染的性伴侶體內(nèi)，從而造成HIV在體內(nèi)廣泛傳播。經(jīng)生殖道黏膜和直腸黏膜感染HIV是目前HIV黏膜感染最主要的2種途徑，90%以上HIV感染者均是通過黏膜感染病毒的[1]。有報道指出，HIV從生殖道部位入侵到宿主體內(nèi)并導(dǎo)致機體系統(tǒng)感染的周期為3～4 d[2,3]。但HIV如何透過黏膜表面進而感染靶細(xì)胞？其中又有哪些細(xì)胞或因子參與到整個感染過程？很多問題尚待深入研究。因此，研究HIV黏膜感染的作用特點及機制至關(guān)重要。

靈長類動物模型無疑是最直觀、有效的研究體系，其在組織結(jié)構(gòu)、免疫和生理等方面均與人類高度相似，能系統(tǒng)、直觀地再現(xiàn)HIV的類似病毒——猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus, SIV)感染宿主的全過程，為臨床研究提供了很大的參考價值。但其價格昂貴，進行深入的基礎(chǔ)性研究存在困難；且SIV與HIV存在明顯差別，宿主不會出現(xiàn)獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrom，AIDS)，不能完全模擬臨床HIV感染患者的情況，也不適合用來研究發(fā)病機制和評價抗病毒藥物和疫苗。此外，不同地域的靈長類動物，如非洲猴及亞洲猴，感染不同的免疫缺陷病毒株后，其免疫反應(yīng)、臨床癥狀和發(fā)病情況都存在較大差異，實驗室之間無法將結(jié)果進行比較，重現(xiàn)性較低。

采用Transwell技術(shù)建立人生殖道黏膜、直腸組織黏膜和細(xì)胞模型，體外模擬HIV在生物體內(nèi)的黏膜感染過程，是目前HIV黏膜感染研究的熱點之一。該模型具有成本低、簡單、易于操作和重現(xiàn)性強等特點，能較為客觀地反映病毒透過黏膜組織或細(xì)胞進而感染機體的過程，更容易觀察特定區(qū)域內(nèi)細(xì)胞及相關(guān)因子在HIV感染前后的變化，從而客觀分析HIV感染機制的研究，是促進HIV感染機制研究較為有效的手段之一。但是該模型也存在一定的缺點，如黏膜組織和黏膜細(xì)胞均屬于離體狀態(tài)，不能完全再現(xiàn)機體病毒感染的復(fù)雜全過程。研究表明，Transwell模型在模擬女性生殖道黏膜感染中存在缺陷，因為該模型中HIV可能通過其他方式透過上皮細(xì)胞，對其嚴(yán)謹(jǐn)性提出質(zhì)疑[4,5]。雖然Transwell技術(shù)在組織及細(xì)胞模型中的應(yīng)用仍存在一定的缺陷和爭議，但不可否認(rèn)其對HIV作用機制的深入研究可提供幫助。

目前，采用Transwell技術(shù)模擬生殖道黏膜及其他屏障系統(tǒng)主要有以下幾種方式。Collins等[6]將人宮頸復(fù)層鱗狀上皮組織黏膜置入上室濾膜，采用瓊脂糖凝膠灌注封閉，并留空中心1圈，將病毒與未封閉的黏膜表面接觸來研究其與黏膜組織的相互作用。Shen等[7]則將黏膜組織置入上室，在黏膜面上放置聚丙烯小桶，以外科手術(shù)用凝膠將小桶四周封閉。常用細(xì)胞模型主要選用原代培養(yǎng)細(xì)胞或可永生化傳代的細(xì)胞系。如Nazli等[8]利用女性生殖道原代上皮細(xì)胞和T84腸道細(xì)胞系，建立了生殖道黏膜及腸黏膜Transwell模型，研究了HIV-1對黏膜屏障的損傷作用。Bai等[9]選用人D407視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系建立血-視網(wǎng)膜屏障模型，研究HIV-1 Tat蛋白對HIV感染黏膜細(xì)胞的影響。這些Transwell模型具有各自的優(yōu)缺點，都有一定的應(yīng)用，但均需進一步完善。

3 Transwell技術(shù)在研究HIV黏膜感染中的應(yīng)用

宿主黏膜基底層中存在大量表面帶有CD4受體的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，這些正是HIV作用的靶細(xì)胞。有研究表明[10,11]，HIV黏膜感染主要通過黏膜上皮層中的朗格漢斯細(xì)胞(Langerhans cell, LC)、樹突細(xì)胞(dendritic cell, DC)及M細(xì)胞(microfold cell)等，經(jīng)跨膜轉(zhuǎn)運方式將病毒轉(zhuǎn)運至基底層的HIV靶細(xì)胞。以上研究大多是在動物模型中進行的。Hanley等[12]從血液中分離出DC和T細(xì)胞，并對核受體家族中的過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor, PPARγ)和肝X受體(liver X receptor，LXR)在HIV傳播中的活性作用進行驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，能激活PPARγ和LXR的藥物可抑制DC捕捉HIV及將HIV傳遞給T細(xì)胞的能力。因此，Transwell技術(shù)對深入研究HIV經(jīng)黏膜轉(zhuǎn)運進入機體靶細(xì)胞的機制有較大的應(yīng)用價值。

3.1 生殖道及直腸黏膜上皮細(xì)胞

性傳播主要包括異性性傳播及同性性傳播。異性性傳播感染的途徑主要是透過生殖道黏膜屏障，包括子宮頸及陰道黏膜屏障。而透過直腸黏膜屏障是同性性傳播感染的最主要方式。Nazli等[8]用女性生殖道原代上皮細(xì)胞和T84腸道細(xì)胞系建立生殖道黏膜及腸黏膜的Transwell模型，研究HIV-1破壞黏膜功能的機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黏膜暴露于HIV顆粒24 h后，Transwell模型的膜跨上皮電阻(transepithelial resistance, TER)降低了30%～60%，生殖道及腸黏膜屏障的通透性增加。進一步研究表明，腸黏膜上皮直接應(yīng)答于HIV-1包膜糖蛋白，上調(diào)炎性細(xì)胞因子表達(dá)而使屏障功能受損。這一機制可能對研究HIV-1黏膜傳播和免疫激活有幫助。

3.2 濾泡樹突細(xì)胞

濾泡樹突細(xì)胞(follicular dendritic cell, FDC)存在于二級淋巴組織的生發(fā)中心[13]，與T細(xì)胞和B細(xì)胞緊密接觸，對免疫記憶的維持，B細(xì)胞的分化、成熟及記憶B細(xì)胞的形成均具有極其重要的作用[14,15]。研究發(fā)現(xiàn)[16]，F(xiàn)DC細(xì)胞是HIV感染的第1道防線。機體感染HIV后，F(xiàn)DC通過細(xì)胞表面的DC特異性細(xì)胞間黏附分子3結(jié)合非整合素因子(dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin，DC-SIGN)吸附大量病毒顆粒，但其本身不被HIV感染，即使在高濃度中和抗體存在下，其吸附的HIV-抗體免疫復(fù)合物依然具有很高的感染性[17-20]。另有研究表明，F(xiàn)DC可捕捉HIV，藏于胞內(nèi)，且在不復(fù)制的情況下長期保持活性，條件適宜時病毒又可大量復(fù)制[21]。

目前，采用Transwell技術(shù)研究FDC對HIV的作用也是研究熱點。姜擁軍等[22]將1×106個淋巴細(xì)胞置于Transwell上室，將2×106個FDC置于下室，進行趨化實驗。結(jié)果表明，F(xiàn)DC對淋巴細(xì)胞有明顯的趨化作用。該實驗還同時評估了FDC對HIV結(jié)合及進入淋巴細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)DC可增強HIV在淋巴細(xì)胞內(nèi)的感染[23,24]，可能原因是其能促進HIV復(fù)制。另有研究表明，F(xiàn)DC可延長HIV的體外存活時間[25]。

3.3 T細(xì)胞

HIV經(jīng)黏膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運到達(dá)黏膜下層后，需與靶細(xì)胞(即T細(xì)胞)特異性結(jié)合，進而進入宿主體內(nèi)。白細(xì)胞介素7(interleukin 7，IL-7)是維持外周成熟T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子，在病毒感染后的免疫應(yīng)答及病毒特異性CD4+和CD8+記憶性T細(xì)胞庫的產(chǎn)生及維持過程中發(fā)揮重要作用[26]。對IL-7的特異性應(yīng)答主要通過CD127表達(dá)調(diào)控，Vranjkovic等[27]將感染HIV的外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)在Transwell小室中培養(yǎng)，之后將CD8+T細(xì)胞暴露于Transwell小室中，結(jié)果CD8+T細(xì)胞表面CD127表達(dá)下降。Lang等則發(fā)現(xiàn)，HIV感染的CD4+T細(xì)胞分泌Tat蛋白，通過旁分泌可特異性下調(diào)CD127在各型CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)，且這種下調(diào)作用是可逆的。效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞表面CD127表達(dá)下調(diào)可促進效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞凋亡，記憶性CD8+T細(xì)胞耗盡，導(dǎo)致病毒持續(xù)感染[28]。此外，HIV還可對CD4+T細(xì)胞表面的CD127表達(dá)產(chǎn)生影響。最近研究表明，在HIV感染早期，由于免疫系統(tǒng)活化水平提高及CD4+T細(xì)胞凋亡增加，CD4+T細(xì)胞表面CD127表達(dá)水平降低[29]。CD127在CD4+T細(xì)胞表達(dá)缺失引起的細(xì)胞凋亡及CD127記憶性CD4+T細(xì)胞因感染HIV而死亡，是HIV感染中CD4+T細(xì)胞缺失的重要原因之一[30]。探究CD127與HIV的關(guān)系，為HIV的防治提供了新途徑。

4 Transwell技術(shù)在HIV穿透機體其他屏障系統(tǒng)中的應(yīng)用

4.1 血-腦屏障

血-腦屏障是維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和避免有害物質(zhì)入侵的必需結(jié)構(gòu)，是機體參與天然免疫的內(nèi)部屏障之一，可保護大腦不被血液中的微生物和毒素傷害[31]。研究表明，20%的AIDS患者感染HIV-1后，HIV-1包膜蛋白gp120可改變血-腦屏障的完整性[32]，病毒會透過血-腦屏障進入大腦，在腦內(nèi)繁殖并破壞大腦組織，從而產(chǎn)生HIV癡呆癥或其他認(rèn)知障礙。對HIV穿透血-腦屏障導(dǎo)致功能障礙的機制，目前尚無定論。建立體外血-腦屏障模型對該問題的解決具有重要意義。

Chaudhuri等[33]將感染HIV-1的單核-巨噬細(xì)胞和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞在Transwell小室中共培養(yǎng)，觀察HIV基因變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIV-1損壞血-腦屏障的機制與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的炎癥、細(xì)胞因子及干擾素信號有關(guān)。Eugenin等[34]研究表明，少數(shù)感染HIV的星狀膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)損傷中起重要作用，該毒性機制對研究中樞神經(jīng)損傷和控制HIV導(dǎo)致的認(rèn)知障礙有較大貢獻(xiàn)。另有研究發(fā)現(xiàn)，來源于腸道細(xì)菌細(xì)胞壁的化學(xué)成分脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可協(xié)助HIV透過血-腦屏障進入大腦，而HIV感染者血液中LPS含量極高。此外，CD40和CD40配體在HIV透過血-腦屏障過程中也有促進作用[35]，該研究成果為防御HIV侵入大腦提供了實驗依據(jù)。

4.2 血-視網(wǎng)膜屏障

HIV-1 Tat蛋白是HIV基因組編碼的重要調(diào)控蛋白之一，為HIV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需；且其中蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(protein transduction domain，PTD)具有信號肽作用，能有效引導(dǎo)多肽片段或蛋白進入細(xì)胞，具有蛋白傳送功能，是目前生物制品中加在蛋白或多肽前促進多肽跨膜轉(zhuǎn)運的主要序列之一。Bai等[9]選用人D407視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系建立血-視網(wǎng)膜屏障Transwell模型，用以研究HIV-1 Tat蛋白對其的影響。結(jié)果顯示，HIV-1 Tat蛋白能顯著提高視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞膜的通透性，改變某些與致密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)，這一效應(yīng)可能與某些炎癥因子的激活有關(guān)。2011年，李太生等研究發(fā)現(xiàn)[36]，長期接受抗HIV藥物治療的AIDS患者雖然血液中病毒檢測已呈陰性，但其淚液中仍有較高病毒載量，淚腺、淚液及相關(guān)組織和器官很可能是HIV的新“據(jù)點”，這也為HIV與血-視網(wǎng)膜屏障的相互作用提供了新的研究方向。

5 結(jié)語

隨著全球HIV/AIDS感染人群持續(xù)增長，對HIV感染的防治日益引起人們的重視。目前，性傳播尤其是異性間無保護的性傳播已成為HIV傳播的最主要方式。人體自身存在著一些生理屏障系統(tǒng)，能天然抵抗外來病毒的入侵，如人生殖道及直腸黏膜，這些屏障系統(tǒng)的存在也大大降低了HIV及其他性傳播疾病病原體的感染性。據(jù)報道，天然黏膜屏障系統(tǒng)損傷或炎癥感染患者中，HIV感染率很高。迄今為止，科學(xué)家一直致力研究HIV黏膜感染及病毒穿透機體屏障系統(tǒng)的具體機制，但尚未闡釋清楚。HIV直接感染人黏膜及其他屏障系統(tǒng)的相關(guān)研究很難操作，其模擬性實驗也存在很多問題。理論上，預(yù)防HIV感染的最好手段是開發(fā)成功的HIV疫苗。在目前缺乏有效疫苗且研發(fā)成功的疫苗尚需很長一段時間的情況下，開發(fā)能有效抑制HIV傳播的殺微生物制劑也是有效途徑之一，但靈長類動物模型的缺陷部分限制了疫苗及藥物的研發(fā)。采用Transwell技術(shù)在一定程度上為解決這些難題提供了一種方案，可在體外模擬HIV感染機體的黏膜及屏障系統(tǒng)，從而使HIV感染機制及疫苗和抗病毒藥物的研究能深入展開。目前Transwell技術(shù)也的確推進了HIV感染機制的研究，如HIV-1對黏膜屏障的損傷作用、FDC對HIV復(fù)制的促進作用等。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，陰道而非腸道巨噬細(xì)胞允許HIV復(fù)制[37]和包皮環(huán)切術(shù)能降低HIV感染率[38]等，這些均是Transwell技術(shù)研究成果的體現(xiàn)，為深入研究HIV感染機制、HIV黏膜保護疫苗的開發(fā)以及新藥物作用靶點的尋找和確認(rèn)提供了良好的技術(shù)平臺。

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