α干擾素和利巴韋林抗丙型肝炎病毒作用的比較研究

楊猛，何勝菲，任浩，趙蘭娟，戚中田

1. 第二軍醫(yī)大學(xué)研究生管理大隊臨床十隊，上海 200433； 2. 第二軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室，上海市醫(yī)學(xué)生物防護(hù)重點實驗室，上海 200433

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染可導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞肝癌及一些自身免疫性疾病，感染人數(shù)約1.7億[1]。然而，治療HCV感染可供選擇的藥物極其有限。α干擾素(interferon α, IFN-α)聯(lián)合利巴韋林是臨床治療丙型肝炎的標(biāo)準(zhǔn)方案。IFN-α作為抗病毒感染的第1道防線，在病毒感染人體后迅速發(fā)揮抑制病毒復(fù)制和增強(qiáng)免疫反應(yīng)的作用[2]。研究表明，IFN誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與其抗病毒效應(yīng)有關(guān)。IFN與細(xì)胞表面特定受體結(jié)合后啟動相應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子的經(jīng)典途徑，從而調(diào)節(jié)一系列干擾素刺激基因(interferon-stimulated gene,ISG)的表達(dá)，發(fā)揮抗病毒效應(yīng)[3,4]。利巴韋林是于1970年發(fā)現(xiàn)的具有廣譜抗病毒活性的鳥嘌呤類似物，通過抑制鳥嘌呤合成，使病毒缺乏合成RNA所需的鳥嘌呤而無法復(fù)制。

由于高效體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和合適小動物模型的長期缺乏，阻礙了對HCV致病機(jī)制的深入了解及抗病毒藥物和疫苗的研制。近年來，感染性細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的HCV(cell culture-derived HCV, HCVcc)的建立極大地推動了HCV致病機(jī)制研究、藥物篩選和疫苗研制工作[5-7]。本研究采用體外培養(yǎng)的感染性病毒HCVcc為研究對象，比較IFN-α和利巴韋林對HCV復(fù)制的影響，以及對干擾素調(diào)節(jié)因子9(interferon regulatory factor 9, IRF9)和ISG15等抗病毒基因的調(diào)節(jié)能力。

1 材料和方法

1.1 主要材料

重組人IFN α-2a 和利巴韋林分別為PBL和Merck產(chǎn)品。DMEM 和胎牛血清為HyClone產(chǎn)品。HCV NS3鼠單克隆抗體(簡稱單抗)和β-actin抗體分別購自Abcam和Cell Signaling Technology公司。HCV E2鼠單抗由Chiron公司Dr. Houghton提供。辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)-羊抗兔或抗鼠抗體和TRIzol試劑購自Invitrogen公司。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑為Millipore產(chǎn)品。莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，M-MLV)反轉(zhuǎn)錄酶為Promega公司產(chǎn)品。SYBR Green PCR Kit 購自百泰克公司。Huh7.5.1細(xì)胞和HCVcc(J6/JFH1，基因型2a)由本實驗室提供，其中HCV 2a J6/JFH株全長基因組質(zhì)粒FL-J6/JFH1由美國洛克菲勒大學(xué)HCV研究中心Dr. Rice教授惠贈。HCVcc的制備及效價測定參見文獻(xiàn)[8]。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)Huh7.5.1細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)液中添加2 mmol/LL-谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、100 μg/ml鏈霉素和100 u/ml青霉素。

1.2.2IFN和利巴韋林處理細(xì)胞Huh7.5.1細(xì)胞種植于24孔板內(nèi)培養(yǎng)過夜，吸棄培養(yǎng)液，用磷酸緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗1次；將1×105FFU/ml HCVcc以30 μl/孔于37 ℃培養(yǎng)2 h，吸棄病毒液，用PBS洗1次。將含不同濃度IFN-α(0、100、200、400、800、1 000 u/ml用于檢測HCV RNA，5、10、20、40、80、100 u/ml用于檢測抗病毒基因水平)和利巴韋林(0、1、20、100 μg/ml用于檢測HCV RNA水平和蛋白表達(dá)，1、5 μg/ml用于檢測抗病毒基因水平)的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基加入孔內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h或96 h。細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后分別制備RNA和蛋白樣品，用于實時聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction， PCR)和蛋白免疫印跡檢測。

1.2.3引物合成HCV 5′非編碼區(qū)上游引物：5′-CTTCACGCAGAAAGCGTCTA-3′；下游引物：5′-CAAGCACCCTATCAGGCAGT-3′。內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-TGGGCTACACTGAGCACCAG-3′；下游引物：5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAAT-3′。IRF9上游引物：5′-CCACCGAAGTTCCAGGTA-ACAC-3′；下游引物：5′-AGTCTGCTCCAGCAA-GTATCGG-3′。ISG15上游引物：5′-CTCTGA-GCATCCTGGTGAGGAA-3′；下游引物：5′-AA-GGTCAGCCAGAACAGGTCGT-3′。上述引物委托上海英駿生物技術(shù)公司合成。

1.2.4實時PCR用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及條件：1 μg RNA，DEPC水補(bǔ)至10 μl，與100 μmol/L隨機(jī)引物 1 μl混勻，于70 ℃水浴5 min，立即冰浴2 min；然后加入5×M-MLV Buffer 5 μl、10 mmol/L dNTP 1.5 μl、M-MLV 1 μl，DEPC水補(bǔ)至25 μl，混勻于37 ℃水浴1 h以合成cDNA。以上述cDNA作為模板，分別擴(kuò)增HCV、IRF9、ISG15和GAPDH。反應(yīng)體系和條件：cDNA模板 2 μl、2×SYBR Green I 10 μl、上游引物(10 μmol/L)0.4 μl、下游引物(10 μmol/L)0.4 μl、雙蒸水7.2 μl，混勻后用Rotor-Gene 3000熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 25 s，共40個循環(huán)。選定未處理組細(xì)胞樣品作為對照，經(jīng)內(nèi)參GAPDH均一化處理，用DeltaDelta CT Relative Quantitation進(jìn)行相對定量分析。所用軟件為Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.1。

1.2.5蛋白免疫印跡法蛋白樣品制備參見文獻(xiàn)[9]。樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5% 脫脂奶粉封閉1 h；膜與HCV NS3鼠單抗(1∶1 000)、HCV E2鼠單抗(1∶500)或β-actin抗體(1∶1 000)于4 ℃過夜，與1∶1 000稀釋的HRP-羊抗兔或抗鼠抗體于室溫孵育1 h。ECL試劑顯影，并用GeneGnome HR image capture獲取圖像。所用軟件為GeneTools from SynGene。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用t檢驗進(jìn)行分析，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量IFN-α對HCV RNA水平的影響

首先評估IFN-α對HCVcc在Huh7.5.1細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的影響。將HCVcc感染的Huh7.5.1細(xì)胞用含不同濃度IFN-α(0、100、200、400、800、1 000 u/ml)的培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h，并抽提細(xì)胞RNA；然后采用實時PCR檢測HCV RNA。圖1表明，100 u/ml IFN-α可顯著降低HCV RNA水平(P<0.05)。

Huh7.5.1 cells infected with HCVcc were cultured in the media containing IFN-α at the indicated doses. Real-time PCR was performed on the extracted RNA. HCV RNA levels are shown as relative percentages of the IFN-α-untreated control. The data are expressed as the mean value and the standard deviation of triplicate experiments.

2.2 利巴韋林和IFN-α對HCV RNA水平及蛋白表達(dá)的影響

將HCVcc感染的Huh7.5.1細(xì)胞用含不同濃度利巴韋林(0、1、20、100 μg/ml)的培養(yǎng)液培養(yǎng)96 h，采用實時PCR檢測細(xì)胞RNA 中HCV RNA水平。圖2A顯示，利巴韋林劑量依賴性抑制HCV復(fù)制，1 μg/ml利巴韋林可顯著降低HCV RNA水平(P<0.05)；且100 u/ml IFN-α聯(lián)合利巴韋林對HCV的復(fù)制具有協(xié)同抑制作用，表現(xiàn)為HCV RNA水平顯著降低(P<0.05)。進(jìn)一步采用蛋白免疫印跡法檢測HCV蛋白在上述處理條件下的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，HCV NS3和E2在HCVcc感染的Huh7.5.1 細(xì)胞中均表達(dá)，而在未感染細(xì)胞中無表達(dá)；利巴韋林對NS3和E2表達(dá)的抑制亦呈劑量依賴性，100 μg/ml利巴韋林或其與100 u/ml IFN-α聯(lián)合應(yīng)用可完全抑制NS3和E2表達(dá)(圖2B)。

A: Huh7.5.1 cells infected with HCVcc were cultured in the media containing various doses of ribavirin or in combination with 100 u/ml IFN-α. Real-time PCR was performed on the extracted RNA. HCV RNA levels are shown as relative percentages of the HCVcc-untreated control. The data are expressed as the mean value and the standard deviation of triplicate experiments. *P<0.05 compared with the untreated control. B: Western blot analysis of HCV NS3 and E2 protein expressions was carried out on protein extracts from the Huh7.5.1 cells treated with ribavirin or IFN-α. β-actin is shown as a loading control. One representative experiment out of two is shown.

2.3 不同劑量IFN-α誘導(dǎo)IRF9和ISG15水平的比較

將檢測IRF9和ISG15水平作為衡量IFN誘生抗病毒基因能力的指標(biāo)。HCVcc感染的Huh7.5.1細(xì)胞用含低劑量IFN-α的培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h后，抽提細(xì)胞RNA。實時PCR檢測結(jié)果顯示，在HCVcc感染的Huh7.5.1細(xì)胞，5～80 u/ml IFN-α可劑量依賴性誘生IRF9(圖3A)。與IRF9相似，ISG15也被5～80 u/ml IFN-α劑量依賴性促進(jìn)誘生，且ISG15水平增加明顯高于IRF9(圖3B)。有趣的是，100 u/ml IFN-α卻導(dǎo)致IRF9和ISG15水平開始降低。

Huh7.5.1 cells infected with HCVcc were cultured in the media containing various doses of IFN-α. Real-time PCR was performed on the extracted RNA. mRNA levels of IRF9 (A) and ISG15 (B) after 72 h treatment with IFN-α in cells with and without HCVcc infection were detected. The data are expressed as the mean value and the standard deviation of triplicate experiments.

2.4 不同劑量利巴韋林聯(lián)合IFN-α誘導(dǎo)IRF9和ISG15水平的比較

繼續(xù)研究利巴韋林單獨及聯(lián)合IFN-α對IRF9和ISG15的影響。結(jié)果如圖4所示，在HCVcc感染的Huh7.5.1細(xì)胞，用1和5 μg/ml利巴韋林孵育96 h并不促進(jìn)IRF9和ISG15水平升高；用20 u/ml IFN-α孵育則明顯促進(jìn)IRF9和ISG15水平升高；而利巴韋林聯(lián)合IFN-α對IRF9和ISG15誘生無促進(jìn)作用。

Huh7.5.1 cells infected with HCVcc were cultured in the media containing various doses of ribavirin and IFN-α. Real-time PCR was performed on the extracted RNA. mRNA levels of IRF9 (A) and ISG15 (B) after 96 h treatment with ribavirin in cells with and without HCVcc infection were detected. The data are expressed as the mean value and the standard deviation of triplicate experiments.

3 討論

目前，主要采用IFN聯(lián)合利巴韋林治療HCV感染。慢性HCV感染患者對該方案的持續(xù)病毒應(yīng)答率平均為47%～54%，其中HCV基因1型約為40%，而基因2型為85%～90%，表現(xiàn)出較好的臨床效應(yīng)[10,11]。為進(jìn)一步比較IFN-α和利巴韋林的抗病毒效應(yīng)，本研究采用可模擬病毒天然感染的體外培養(yǎng)HCVcc為研究對象，探討IFN-α、利巴韋林單獨或聯(lián)合應(yīng)用對HCV RNA水平、蛋白表達(dá)及抗病毒基因的影響。實驗結(jié)果表明，IFN-α和利巴韋林劑量依賴性抑制HCV復(fù)制，且IFN-α聯(lián)合利巴韋林對HCV RNA水平及HCV NS3和E2蛋白表達(dá)具有協(xié)同抑制作用。此外，IFN-α可誘生IRF9和ISG15，而利巴韋林并不提高兩者的水平。

IFN聯(lián)合利巴韋林治療HCV感染表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗病毒效應(yīng)，闡明兩者的抗病毒分子機(jī)制對提高療效具有重要意義。Rice等利用含全長HCV 1b復(fù)制子的細(xì)胞作為實驗材料，比較IFN-α和IFN-λ對HCV復(fù)制的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者劑量依賴性抑制HCV復(fù)制[12]。有臨床資料表明，對于感染HCV基因1型的患者，利巴韋林劑量為1 000 mg/d(體重≤75 kg)或1 200 mg/d(體重>75 kg)；對于感染其他基因型的絕大多數(shù)患者，利巴韋林劑量為800 mg/d即可維持滿意的持續(xù)病毒應(yīng)答率[13]。本實驗則進(jìn)一步研究IFN-α和(或)利巴韋林對感染性病毒HCVcc復(fù)制的影響。結(jié)果顯示，100 u/ml IFN-α可顯著降低HCV RNA水平。利巴韋林不僅劑量依賴性降低HCV RNA水平，還對NS3和E2蛋白的表達(dá)呈劑量依賴性抑制。此外，IFN-α聯(lián)合利巴韋林對HCV RNA水平和蛋白表達(dá)均有協(xié)同抑制作用。本實驗結(jié)果不僅與相關(guān)報道一致，還深入探討了IFN-α、利巴韋林體外抗病毒作用的量-效關(guān)系。

IFN-α通過誘導(dǎo)一系列具有抗病毒作用的效應(yīng)蛋白表達(dá)，在細(xì)胞內(nèi)建立抗病毒狀態(tài)，抑制病毒復(fù)制，從而發(fā)揮抗病毒效應(yīng)[14]。因此，了解抗病毒基因在IFN治療前后的變化，有助于從分子水平闡明IFN治療HCV的機(jī)制。IFN-α持續(xù)作用時間與某些相關(guān)基因之間的關(guān)系也令人感興趣。聚乙二醇IFN-α治療前后慢性丙型肝炎患者肝臟切片的研究表明，對IFN-α治療敏感的患者，IFN-α誘導(dǎo)ISG表達(dá)強(qiáng)烈上調(diào)；對其無效的患者，治療前ISG已高水平表達(dá)，IFN-α處理并不能使其表達(dá)進(jìn)一步增高[15]。本研究選擇IRF9和ISG15作為評價IFN-α抗病毒效應(yīng)的指標(biāo)。結(jié)果顯示，在HCVcc感染的Huh7.5.1細(xì)胞中，IFN-α在一定范圍內(nèi)劑量依賴性促進(jìn)IRF9和ISG15 mRNA水平升高，且ISG15水平上升高于IRF9；而低劑量利巴韋林并不促進(jìn)兩者mRNA水平上升。此結(jié)果與最近的一篇報道一致[16]，但對IRF9和ISG15蛋白表達(dá)水平的影響仍有待研究。此外，100 u/ml IFN-α導(dǎo)致IRF9和ISG15水平開始降低的機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。在前期實驗中，我們發(fā)現(xiàn)1和5 μg/ml利巴韋林聯(lián)合20 u/ml IFN-α對HCVcc復(fù)制具有協(xié)同抑制作用。本文在兩者協(xié)同抑制HCVcc復(fù)制的基礎(chǔ)上，繼續(xù)研究低劑量利巴韋林和IFN-α對ISG表達(dá)的影響(圖4)。結(jié)果表明，利巴韋林聯(lián)合IFN-α對IRF9和ISG15誘生無促進(jìn)作用。因此，IFN-α聯(lián)合利巴韋林對HCV復(fù)制具有協(xié)同抑制作用，但兩者具有不同調(diào)節(jié)抗病毒基因表達(dá)的能力。

綜上所述，本研究初步揭示了IFN-α、利巴韋林體外抗病毒作用的量-效關(guān)系及兩者誘導(dǎo)抗病毒基因的差異。作為大多數(shù)病毒的通用策略，HCV干預(yù)IFN介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制其誘導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)，允許病毒逃逸宿主免疫應(yīng)答，從而建立感染。HCV可能擁有數(shù)種機(jī)制以拮抗IFN或利巴韋林的抗病毒效應(yīng)。HCV與抗病毒藥物相互作用的過程涉及多種病毒、宿主、信號分子和抗病毒基因產(chǎn)物的綜合作用，深入理解HCV與抗病毒藥物相互作用的分子機(jī)制將提高以IFN為基礎(chǔ)治療方案的療效，形成新的治療措施。

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