沙丁胺醇?xì)忪F劑微生物限度檢查的方法建立和驗(yàn)證

霍天鳳

(河南省焦作市食品藥品檢驗(yàn)所 河南焦作 454000)

微生物限度檢查是檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法,檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)以及控制菌檢查[1]。是對(duì)生產(chǎn)單位是否按GMP規(guī)范生產(chǎn)的驗(yàn)證。在實(shí)際檢驗(yàn)工作中,由于某些藥品成分具有抗菌活性,抑制了藥品中微生物的生長(zhǎng),按常規(guī)法檢驗(yàn)不能真實(shí)地反映藥品中污染微生物的情況,必須先消除供試品中的抑菌活性,再根據(jù)中國(guó)藥典規(guī)定的方法進(jìn)行檢查[2～4],同時(shí),必須對(duì)所采用的檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證,以確認(rèn)其抑菌活性的消除和檢查方法的有效性和可靠性。

沙丁胺醇為選擇性較強(qiáng)的β2受體激動(dòng)劑,吸入時(shí)對(duì)心臟的興奮作用比異丙腎上腺素小,沙丁胺醇擴(kuò)張支氣管作用,第一秒鐘最大呼吸量和心率增加作用隨劑量平行上升,其擴(kuò)張支氣管作用約為心率作用的8倍。沙丁胺醇?xì)忪F劑中含有乙醇,具有抑菌作用,顯然不能用常規(guī)的微生物限度檢查方法,本文采用薄膜過(guò)濾法,并進(jìn)行方法驗(yàn)證,結(jié)果薄膜過(guò)濾法用于沙丁胺醇?xì)忪F劑的微生物限度檢查科學(xué)、準(zhǔn)確。

1 儀器與材料

1.1 儀器

GHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(慧科電子);SPX-150型生化培養(yǎng)恒溫箱(慧科電子);LMQ.C-3260J型立式滅菌器(山東新華);凈化工作臺(tái)(蚌埠);Htysteritest601集菌儀(杭州高得);精密移液器。

1.2 材料

菌種:大腸埃希菌[CMCC(B)44 102];金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26 003];枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63 501];白色念珠菌[CMCC(F)98 001];銅綠假單胞菌[CMCC(B)10 104](以上菌種均從河南省食品藥品檢驗(yàn)所購(gòu)買(mǎi))。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基;營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基;改良馬丁培養(yǎng)基;玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基;膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基;溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基;甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基;MUG試劑;pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(以上培養(yǎng)基均由中國(guó)藥品生物制品檢定所監(jiān)制);靛基質(zhì)試液;氯化鈉。

樣品:沙丁胺醇?xì)忪F劑(批號(hào)分別為1104004,1107024,1106005)。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果

2 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)

2.1 供試液對(duì)照組試驗(yàn)

取樣品冷凍1h,消毒開(kāi)啟部位,無(wú)菌鋼錐鉆孔,放至室溫,待拋射劑全部釋出,用無(wú)菌注射器吸出藥液,用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋成1:10供試液。

取供試液1mL注入100mLpH7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液,搖勻,以無(wú)菌操作用裝有直徑50mm、孔徑為0.45um微孔濾膜的過(guò)濾器過(guò)濾,用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液沖洗濾膜,每張濾膜沖洗量100mL,制4張濾膜,取出濾膜,菌面朝上,其中2張貼于凝固的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上,35℃倒置培養(yǎng)48h;另2張貼于凝固的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上,25℃倒置培養(yǎng)72h。培養(yǎng)后計(jì)數(shù),為供試液對(duì)照組數(shù)據(jù)。

2.2 菌液組試驗(yàn)

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,35℃培養(yǎng)18～24h,取上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1mL含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌液的稀釋倍數(shù)一般為106～107,枯草芽孢桿菌的稀釋倍數(shù)一般為104～105)。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中,25℃培養(yǎng)24～48h。取上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1mL含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液(稀釋倍數(shù)一般為104～105)。

分別取以上各菌懸液1 m L注入100mLpH7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液中,搖勻,以無(wú)菌操作,用裝有直徑50mm、孔徑為0.45um微孔濾膜的過(guò)濾器過(guò)濾,過(guò)濾后,取出濾膜,菌面朝上,大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的濾膜貼于凝固的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上,30～35℃倒置培養(yǎng)48h;白色念珠菌的濾膜貼于凝固的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上,23～28℃倒置培養(yǎng)72h。培養(yǎng)后計(jì)數(shù)為菌液組數(shù)據(jù)。

2.3 試驗(yàn)組試驗(yàn)

取1∶10供試液1mL注入100mLpH7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液,搖勻,以無(wú)菌操作用裝有直徑50mm、孔徑為0.45um微孔濾膜的過(guò)濾器過(guò)濾,用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液沖洗濾膜,每張濾膜沖洗量100mL,在最后一次沖洗液中加入1mL含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液,過(guò)濾后,取出濾膜,菌面朝上,加大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的濾膜貼于凝固的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上,30～35℃倒置培養(yǎng)48h;加白色念珠菌的濾膜貼于凝固的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上,23～28℃倒置培養(yǎng)72h。培養(yǎng)后計(jì)數(shù)為試驗(yàn)組數(shù)據(jù)。

2.4 回收率計(jì)算

用實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)減供試品對(duì)照組數(shù)據(jù),然后除以菌液組數(shù)據(jù),即為試驗(yàn)菌回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

以上結(jié)果表明:各菌液回收率均＞70%,符合藥典要求,說(shuō)明薄膜過(guò)濾法可用于沙丁胺醇?xì)忪F劑的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)。

3 控制菌檢查

3.1 方法

取2.1項(xiàng)1:10供試液10mL按2.3方法制備濾膜,在最后一次沖洗液中分別加大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌。加大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的濾膜分別置100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～24h,加金黃色葡萄球菌的濾膜置100ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～24h。

取大腸埃希菌培養(yǎng)液0.2mL置5mLMUG培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng),分別于5、24h時(shí),366nm紫外光下觀察。觀察之后,加數(shù)滴靛基質(zhì)試液于MUG管內(nèi),觀察。

取銅綠假單胞菌的培養(yǎng)液劃線(xiàn)接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上,培養(yǎng)18～24h,觀察。

取金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)液劃線(xiàn)接種于甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基平板,培養(yǎng)24～72h,觀察。

3.2 結(jié)果

大腸埃希菌的MUG管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光,加靛基質(zhì)試液后,液面呈玫瑰紅色,為大腸埃希菌陽(yáng)性。金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的平板也呈典型陽(yáng)性菌落。說(shuō)明此方法可以消除沙丁胺醇?xì)忪F劑中抑菌成分的干擾,檢出試驗(yàn)菌,符合藥典規(guī)定,可以用于沙丁胺醇?xì)忪F劑的控制菌檢查。

以上試驗(yàn)證明,薄膜過(guò)濾法可用于沙丁胺醇?xì)忪F劑的微生物限度檢查,其結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

4 討論

(1)微生物限度檢查是檢查生產(chǎn)企業(yè)是否按GMP規(guī)范生產(chǎn)的一種手段,是藥品標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)重要項(xiàng)目,可由于藥品成分復(fù)雜,尤其是抗生素、抗菌藥和某些中成藥,它們有特殊的抑菌作用,因此,以前的常規(guī)法檢查微生物限度就不能反映藥品的真實(shí)情況,出現(xiàn)假陰性,漏檢現(xiàn)象,導(dǎo)致這些藥品到人體內(nèi),溫度營(yíng)養(yǎng)均適宜的環(huán)境下重新復(fù)蘇、繁殖生長(zhǎng),危害人的健康。因此,研究制定出科學(xué)、準(zhǔn)確、可靠、規(guī)范的微生物限度檢查方法勢(shì)在必行[5～7]。

(2)沙丁胺醇?xì)忪F劑是呼吸道用藥,必須檢查金黃色葡萄球、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌等控制菌,因此需要做這3個(gè)控制菌的方法學(xué)驗(yàn)證。

(3)本文的所有試驗(yàn)均需作空白試驗(yàn)或空白對(duì)照試驗(yàn)。

(4)濾膜應(yīng)菌面朝上放在培養(yǎng)基平板上,這樣膜上的細(xì)菌才可以更好的在氧和養(yǎng)的環(huán)境下生長(zhǎng)。

[1] 中華人民共和國(guó)國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(二部)[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄107～116.

[2] 鐘長(zhǎng)鳴,陳曦,吳燕紅.微生物限度和無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證中存在的問(wèn)題[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn),2011(1):12～13.

[3] 陳萬(wàn)里,李勇軍,王永林,等.紫金透骨噴霧劑微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證研究[J].中國(guó)藥房,2010,19(43):4090～4092.

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[6] 馬鳴曉.地級(jí)市藥檢所開(kāi)展無(wú)菌和微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證工作之我見(jiàn)[J].中國(guó)藥師,2008(9):1105～1106.

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