HLA-Ⅰ基因單核苷酸多態(tài)性與中國南方漢族女性乳腺癌易感性的相關性研究①

佟 琳 楊學習 李粉霞 孫敏英 劉民鋒 董建宇 郭昭澤 葉長生

(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院乳腺科，廣州510515)

目前，乳腺癌已成為女性最常見的惡性腫瘤。 2008年全球乳腺癌新增病例約138萬，占所有新發(fā)癌癥病例的22.9%(IARC：Cancer Epidemiology Database， GLOBOCAN.2008 ［http：//www-dep.iarc.fr］)。近幾年，雖然美國等西方發(fā)達國家的乳腺癌發(fā)病率和死亡率呈下降趨勢;但在中國卻逐年增長，2008年中國乳腺癌新發(fā)病例(16.9萬)比2002年(12.6萬)(IARC：Cancer Epidemiology Da-tabase，GLOBOCAN.2002 ［http：//www-dep.iarc.fr/］)增長了34%。

HLA是機體免疫識別，免疫應答及免疫調節(jié)的重要系統(tǒng)［1］。它決定機體的組織相容性，并以其多基因性和高度多態(tài)性成為人類的重要遺傳標記［2］。HLA基因定位于人類染色體6p21.3區(qū)域，可分為HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ、HLA-Ⅲ 3 個區(qū)域。目前已證明HLA參與腫瘤細胞逃避機體免疫監(jiān)視過程，與多個系統(tǒng)性疾病存在相關性［2-4］。HLA-Ⅰ類分子廣泛分布于人體有核細胞表面，參與內源性抗原肽的加工、處理和提呈［5］。HLA-Ⅰ已被證實與多種腫瘤易感性相關［6-8］。HLA-Ⅰ類分子的表達降低、缺失是腫瘤細胞的一種逃逸方式，主要機制為針對HLA-Ⅰ類分子向T細胞遞呈的免疫原性多肽無法被識別，從而無法殺傷腫瘤細胞［9］。此外，HLA-Ⅰ還是預測乳腺癌復發(fā)、轉移風險的有效指標［10］，但HLA-Ⅰ基因單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)與乳腺癌之間的關系尚不清晰。本文選取了HLA-Ⅰ基因編碼區(qū)的17個單核苷酸多態(tài)性位點，采用病例對照研究，通過 Sequenom MassArray?iPLEX GOLD系統(tǒng)，對中國南方漢族乳腺癌患者267例及健康對照組274例進行基因分型分析，探究其多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病風險的相關性。

1 對象與方法

1.1研究對象 2009年5月12日到2010年7月2日，收集廣州南方醫(yī)院、廣州軍區(qū)總醫(yī)院、江西南昌大學第一附屬醫(yī)院、湛江廣東醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院經病理學確診的乳腺癌患者血液標本267例，平均年齡為(47.8±9.28)歲，中位年齡為47歲。同期收集相應醫(yī)院體檢健康女性274人，要求無乳腺相關病史，無乳腺癌家族史和其它腫瘤病史，平均年齡(51±16.7)歲，中位年齡為49歲。所有對象均為中國南方漢族女性且相互間無血緣關系，獲得知情同意后，取外周血1～2 ml于酸性枸櫞酸葡萄糖抗凝管中，-80℃保存待用。

1.2方法

1.2.1DNA的提取 取外周靜脈血200 μl，用DNA提取試劑盒(北京天根生物技術有限公司，TIANamp Genomic DNA Kit)提取DNA(按說明書操作)，DNA保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物的設計 根據(jù)HLA-Ⅰ編碼區(qū)域的目標序列和所選擇的多態(tài)性位點，利用Sequenom MassArray?Assay Design 3.1軟件設計多重PCR特異性擴增引物和單堿基延伸引物，其中針對各位點的PCR特異性擴增引物和單堿基延伸引物見表1。

表1 17個位點的PCR特異性擴增引物和單堿基延伸引物Tab．1 Specific PCR amplification primer and single base extension primer for 17 SNPs

1.2.3基因分型分析 采用 MassArray?-IPLEX SNP分型技術對所選樣本進行基因分型，步驟如下：將提取純化后的基因組DNA取1.0 μl，按順序加于特定的384孔板上，再添加PCR擴增體系使反應物的終濃度如下：0.1 U的Taq聚合酶，5 ng基因組DNA，各2.5 pmol的 PCR 引物，2.5 mmol的 dNTP。PCR反應條件為：95℃ 2分鐘;95℃ 20秒，56℃ 30秒，72℃ 60秒循環(huán)45次;72℃ 5分鐘;在上述體系中添加0.3 U的堿性磷酸酶，經37℃ 40分鐘，85℃5分鐘的反應去除剩余的dNTP;向體系中添加5.4 pmol的各延伸引物，50 μmol的 dNTP/ddNTP 混合物，0.5 U的Thermosequenase DNA聚合酶，反應條件為：94℃ 2分鐘;94℃ 5秒，50℃ 5秒，72℃ 5秒循環(huán)40次;72℃ 3分鐘。反應產物用樹脂脫鹽15分鐘后經自動點樣儀點樣于SpectroCHIP(Sequenom)芯片，點樣結束后的芯片用基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜(SpectroREADER，Sequenom)進行檢測。對DNA樣品進行質量控制，以保證基因分型成功率為95%以上。

1.2.4數(shù)據(jù)分析 對所選17個位點的基因型分布頻率進行Hardy-Weinberg平衡檢驗后，以在線分析工具http：//bioinfo.iconcologia.net/SNPStats和統(tǒng)計軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行病例-對照和受體狀態(tài)相關性的統(tǒng)計分析，再將病例組樣本按免疫組化結果中雌激素受體(Estrogen receptor，ER)、孕激素受體(Progesterone receptor，PR)、人類表皮生長因子受體2(Human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)狀態(tài)分為陽性組和陰性組。分析過程中采用共顯性(codominant)、顯性(dominant)、隱性(recessive)、超顯性(overdominant)四種遺傳模型。χ2檢驗分析不同分組的基因型頻率有無差異，非條件Logistic回歸計算比數(shù)比OR和95%可信區(qū)間(95%CI)，由此評估所選位點多態(tài)性與乳腺癌的相關性。檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

表2 不符合Hardy-Weinberg平衡的位點的基因型分布Tab．2 Distribution of SNPs inconsistent with the Hardy-Weinberg equilibrium

本研究所選位點在檢測樣本中均存在多態(tài)性，其中 7 個位點 rs2517749、rs1632902、rs4087726、rs9260475、rs9260489、rs9260571、rs9260619 不符合Hardy-Weinberg平衡(表2)，遂在隨后的統(tǒng)計分析析中不在包括在內。關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，rs9260682與乳腺癌的發(fā)病風險和HER-2狀態(tài)存在相關性，rs9260682的AT基因型可增加攜帶者乳腺癌的患病風險(P=0.04)，且與HER-2陰性乳腺癌相關(P=0.04)。rs9260734雖與乳腺癌的發(fā)病風險不存在顯著相關性，但AA基因型與PR陰性乳腺癌相關(P=0.048)，具體結果見表4;其余8個位點rs9404952、 rs9295822、 rs6921314、 rs1632882、rs2517716、rs1632879、rs16896742、rs2571400 基因型分布在病例-對照、ER陽/陰性、PR陽/陰性、HER-2陽/陰性分組中均未顯示有明顯相關性(表3)。

表3 與乳腺癌患病風險無明顯關系的位點的基因型分布Tab．3 Distribution of insignificant SNPs in case-control studies

表4 rs9260682位點多態(tài)性與乳腺癌患病風險的相關性Tab．4 The association of rs9260682 polymorphisms and breast cancer risk

表5 rs9260734位點多態(tài)性與乳腺癌患病風險的相關性Tab．5 The association of rs9260734 polymorphisms and breast cancer risk

2.1 位點rs9260682多態(tài)性與乳腺癌及ER、PR和HER-2狀態(tài)的相關性分析 rs9260682在中國南方漢族女性存在AA、AT兩種多態(tài)性，在總體樣本中的分布頻率分別為96%、4%，在不同組別中的分別頻率如表4。該位點兩種基因型分布在病例-對照分組中有顯著統(tǒng)計學差異(P=0.04)，表明該位點多態(tài)性與乳腺癌易感性明顯相關;在ER陽/陰性、PR陽/陰性分組比較中發(fā)現(xiàn)，基因型分布雖有一定差異，但均無明顯統(tǒng)計學意義(P=0.76、P=0.50);HER-2分組比較結果顯示，該位點的多態(tài)性分布與乳腺癌HER-2狀態(tài)明顯相關(P=0.04)，攜帶雜合型AT者比純合型AA相比更傾向于HER-2陰性乳腺癌(OR=0.14，95%CI：0.02-1.23)。

2.2 位點rs9260734多態(tài)性分析與乳腺癌及ER、PR和HER-2狀態(tài)的相關性分析 rs9260734存在AA、GA、GG三種多態(tài)性，在總體研究樣本中的分布頻率分別12%、45%、43%。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)該位點基因型分布在病例-對照、ER陽/陰性和HER-2陽/陰性分組中均無統(tǒng)計學差異(表5);但在PR分組比較中發(fā)現(xiàn)rs9260734的多態(tài)性分布與PR狀態(tài)明顯相關(P=0.048)，AA基因型攜帶者更傾向于PR陰性乳腺癌(OR=0.44，95%CI：0.19-1.01)。

3 討論

乳腺癌的發(fā)病是多基因的作用結果，通過對乳腺癌易感基因的研究中已經發(fā)現(xiàn)，BRCA1和BRCA2是家族性乳腺癌的罪魁禍首。除了尋找易感基因，篩查易感性SNP位點也是乳腺癌基礎研究的一個熱點。作為第三代遺傳標記，SNP更適合作為生物標記在普通人群中進行檢測。全基因組關聯(lián)研究(Genome-wide association studies，GWAS)以大規(guī)模群體DNA樣本的SNP進行全基因組高密度遺傳變異檢測，并利用有效統(tǒng)計方法計算進行病例-對照分析，計算出基因分型變異頻率的差異，最終達到相關的變異與疾病的關聯(lián)分析，從而確定特定基因型的個體患病風險，實施個性化預防策略。目前通過GWAS關聯(lián)分析研究，已發(fā)現(xiàn)與乳腺發(fā)病相關的數(shù)十個基因，如 ABHD8、ANKRD16、CCND1、CDKN2A、CDKN2B、ECHDC1、ESR1、FGFR2、GLG1、GRIK1、KLF4、MAP3K1、MRPS30、TOX3 等的上百個 SNP 位點［11-26］，為了解乳腺癌發(fā)病的分子機制及易感因素提供了更多的線索。但GWAS研究也存在局限性，對已經發(fā)現(xiàn)的腫瘤易感位點需進行大樣本，多人群及相應的功能機制分析。

HLA與許多系統(tǒng)疾病，如運動系統(tǒng)、神經系統(tǒng)和感染性疾病等都存在相關性［6-8］，尤其是參與免疫調節(jié)及應答［27］。此外，HLA還參與腫瘤細胞逃逸免疫監(jiān)視，在許多腫瘤的形成過程中發(fā)揮重要的作用，目前已有研究顯示HLA的多態(tài)性與腫瘤發(fā)生的易感性相關［6，28，29］。根據(jù)千人基因組計劃(http：//www.1000qenomes.orq/)，我們在 HLA-Ⅰ選取了17個SNP位點，探討HLA-Ⅰ基因多態(tài)性與乳腺癌的相關性，研究發(fā)現(xiàn)有7個位點不符合Hardy-Weinberg平衡。這與HLA基因多態(tài)性豐度極高有關，很多關于HLA及疾病的關聯(lián)研究會面臨所獲得的數(shù)據(jù)最終不符合Hardy-Weinberg平衡的問題［30］。

目前有較多證據(jù)顯示，HLA多態(tài)性與肝癌、白血病、卵巢癌、宮頸癌等多種癌癥易感性相關［7，8，31，32］。乳腺癌為女性最常見惡性腫瘤，HLA與乳腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關。早在1990年就發(fā)現(xiàn)HLA在乳腺癌組織表達顯著低于癌旁組織［33］。轉移性乳腺癌組織HLA-Ⅰ的表達亦顯著下降［34］。此外，有研究顯示乳腺癌患者HLA-Ⅰ蛋白表達程度與腫瘤分級明顯相關［10，35，36］，且發(fā)現(xiàn) HLA-Ⅰ表達越低淋巴結轉移越多及無病生存期越短(P＜0.05)［10］。Chardhuri［37］首先發(fā)現(xiàn) HLA 區(qū)域 DQB3*02017/*0202等位基因與乳腺癌發(fā)病風險密切相關。David［38］在對墨西哥散發(fā)乳腺癌的研究中也發(fā)現(xiàn)HLAI基因上DRB1*1602和DQ*0301位點與乳腺癌的發(fā)病風險存在相關性，其他研究同樣顯示HLA-Ⅰ與乳腺癌明顯相關［39，40］，但這些數(shù)據(jù)主要以西方人群為基礎，目前尚無中國人群的相關報道。本研究在中國南方漢族女性中首次發(fā)現(xiàn)HLA-I基因上的rs9260682與乳腺癌患病風險顯著相關。我們實驗室已經報道該位點與鼻咽癌易感性同樣相關［41］，但目前尚無該位點與乳腺癌易感性的相關性研究。

ER、PR、HER-2為乳腺癌指導預后及臨床治療的重要指標，已成為臨床上常規(guī)檢查項目。ER、PR表達陽性的乳腺癌為激素敏感性患者，復發(fā)轉移風險低，預后較好，且適于內分泌治療。HER-2蛋白過表達與乳腺癌惡性程度呈正相關，是重要的預后指標，同時HER-2表達情況為臨床使用赫賽汀靶向治療提供依據(jù)。因此本研究聯(lián)合以上指標來分析HLA遺傳多態(tài)性與其狀態(tài)的相關性。結果顯示rs9260734與PR陰性相關，AA基因型攜帶者更傾向于PR陰性;rs9260682除與乳腺癌發(fā)病風險相關外，其AT基因型比AA基因型更傾向于HER-2陰性乳腺癌。

通過對HLA-I區(qū)域17個SNPs位點與乳腺癌易感性及受體狀態(tài)的相關性研究，發(fā)現(xiàn)rs9260682與中國南方漢族女性中乳腺癌易感性及HER-2陰性相關，rs9260734與乳腺癌PR陰性相關。該研究不僅有助于探討HLA-I在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，也可為乳腺癌的早期診斷和個體化醫(yī)療提供數(shù)據(jù)基礎。

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