葛根素脂質(zhì)體包封率測(cè)定及制備工藝優(yōu)化*

郭 瑩李 莎

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053；2.浙江工業(yè)大學(xué)，浙江 杭州 310000）

葛根素具有防止血小板聚集、抗血栓［1］、改善血流［2］等作用，但其水溶性和脂溶性較差，生物利用度低，體內(nèi)消除半衰期較短，需頻繁給藥［3］，限制了其應(yīng)用。研究表明，脂質(zhì)體對(duì)缺血心肌組織和細(xì)胞具有被動(dòng)靶向作用［4］。將藥物包封于脂質(zhì)體中可改善藥物體內(nèi)的脂水分配系數(shù)，延緩藥物釋放，減少用藥劑量，提高生物利用度［5-6］。本實(shí)驗(yàn)采用薄膜分散法制備葛根素脂質(zhì)體，建立包封率的測(cè)定方法，并采用正交試驗(yàn)優(yōu)化葛根素脂質(zhì)體的制備工藝，為葛根素脂質(zhì)體的研究提供基礎(chǔ)。

1 材 料

752型紫外-可見分光光度計(jì) （上海菁華科技儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 （鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；SPS-2001型電子天平（上海海康電子儀器廠）；葛根素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110752-200209）；大豆卵磷脂（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：W20100601）、膽固醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20080903）；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（分析純，湖州湖試化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水乙醇（分析純，安徽安特生物化學(xué)有限公司）；甲醇（色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；氯仿（分析純，浙江迪耳藥業(yè)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 葛根素脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散法制備：稱取處方量的大豆卵磷脂，膽固醇，溶于10mL氯仿，形成澄明溶液，置于茄型瓶中，38℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，至瓶壁上形成均勻透明的薄膜。另取處方量的葛根素溶于20mL磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH＝7），加入上述附有薄膜的茄型瓶中，攪拌使薄膜溶解，形成混懸液，即得葛根素脂質(zhì)體。上述葛根素磷酸鹽緩沖液中不加葛根素，同法操作即可制得空白脂質(zhì)體。

2.2 葛根素脂質(zhì)體包封率測(cè)定方法的建立

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 精密稱取葛根素對(duì)照品適量，用無(wú)水乙醇配成20μg/mL的溶液，以無(wú)水乙醇為空白溶液，在200～500nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，見圖1。同法對(duì)空白脂質(zhì)體的乙醇溶液掃描，見圖1。結(jié)果葛根素在250nm波長(zhǎng)處有最大吸收，而空白脂質(zhì)體在此波長(zhǎng)無(wú)吸收，故確定用250nm波長(zhǎng)作為葛根素脂質(zhì)體的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 光譜掃描圖

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取葛根素10mg，置于100mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度。精密吸取上述溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于10mL的容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，配成質(zhì)量濃度為 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg/L 的溶液。以70%乙醇為空白溶液，用紫外分光光度計(jì)在250nm波長(zhǎng)處測(cè)定葛根素溶液的吸光度，以質(zhì)量濃度C（mg/L）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得y=0.0835x+0.0008，r=0.9998。

2.2.3 日內(nèi)與日間精密度實(shí)驗(yàn) 取低、中、高3種質(zhì)量濃度（2.0、6.0、10.0mg/mL）葛根素乙醇溶液，1d 內(nèi)連續(xù) 5 次測(cè)定吸光度，考察其日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)5d（每日1次）測(cè)定吸光度，考察其日間精密度。結(jié)果表明，用紫外分光光度法測(cè)定葛根素濃度精密度良好。

表1 日內(nèi)精密度

表2 日間精密度

2.2.4 葛根素游離藥物的回收率實(shí)驗(yàn) 見表3。精密量取0.5mL空白脂質(zhì)體溶液，分別加入低、中、高3種質(zhì)量濃度（2.0、6.0、10.0mg/mL）的葛根素乙醇溶液，用乙醇定容至25mL，測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算葛根素實(shí)際質(zhì)量濃度，計(jì)算回收率。結(jié)果表明游離藥物的回收率符合要求。

表3 游離藥物回收率

2.2.5 空白脂質(zhì)體的干擾實(shí)驗(yàn) 精密移取空白脂質(zhì)體2mL，置于透析袋中，將透析袋置于250mL燒杯中，加入200mL PBS（pH=7），不斷攪拌，分別于 8、12、18、24h 取少量透析外液，用甲醇適當(dāng)稀釋后250nm處測(cè)定吸光度，測(cè)得吸光度值為0，基本確定在24h內(nèi)脂質(zhì)體沒有泄露，對(duì)包封率的測(cè)定沒有干擾。

2.3 葛根素脂質(zhì)體的處方優(yōu)化 以包封率為指標(biāo)，選取3個(gè)主要影響因素：磷脂與膽固醇質(zhì)量比（A）、葛根素與磷脂質(zhì)量比（B），葛根素在PBS中的質(zhì)量濃度（C），每個(gè)因素取3個(gè)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表4，方差分析見表5。根據(jù)直觀分析結(jié)果：影響葛根素脂質(zhì)體包封率的各因素的主次關(guān)系依次為：B＞C＞A，且均為顯著性因素，由此得出的最優(yōu)搭配為：A2B2C1。故確定處方為大豆卵磷脂60mg，膽固醇30mg，溶于10mL氯仿中，作為有機(jī)相；5mg葛根素溶于20mL PBS中作為水相。結(jié)果制得的脂質(zhì)體包封率為64.7%。

表 4 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 方差分析

2.4 初步穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將脂質(zhì)體溶液分別置于冰箱 （4℃）、 室溫 （25℃）、40℃和60℃環(huán)境下，于1、2、3個(gè)月取樣觀測(cè)，以脂質(zhì)體外觀和包封率為指標(biāo)初步考察葛根素脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。結(jié)果見表6，表7。結(jié)果表明制劑在4℃和25℃環(huán)境下，3個(gè)月內(nèi)外觀和包封率無(wú)明顯變化。40℃環(huán)境下，第2個(gè)月開始包封率有所下降。60℃時(shí)，第1個(gè)月包封率即明顯下降，制劑也開始發(fā)黃變黏。因此，制劑應(yīng)盡量低溫保存。

表6 不同溫度下時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體外觀的影響

表7 不同溫度下時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響（%）

3 討 論

脂質(zhì)體的制備方法有許多種，如薄膜分散法、注入法、冷凍干燥法、硫酸銨梯度法等。薄膜分散法是研究最早，最簡(jiǎn)單，現(xiàn)在也經(jīng)常使用的一種制備方法。通過查找文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)完全可以滿足葛根素脂質(zhì)體的制備，故本實(shí)驗(yàn)決定采取該法進(jìn)行脂質(zhì)體的制備。

包封率測(cè)定的關(guān)鍵是將未包封的游離藥物與脂質(zhì)體分離，各種分離方法各有利弊。超濾離心所用的離心管一般是一次性的，成本較高。微柱離心法和葡聚糖凝膠柱法雖效果較好，但操作復(fù)雜，成本也較高。而透析法雖所需時(shí)間較長(zhǎng)，但是操作簡(jiǎn)便，所用的透析袋價(jià)格便宜，用量較少，并可重復(fù)使用，比較經(jīng)濟(jì)，所以本實(shí)驗(yàn)決定采用透析法進(jìn)行游離藥物的分離。實(shí)驗(yàn)中所建立的包封率的測(cè)定方法穩(wěn)定可靠、且空白脂質(zhì)體對(duì)濃度測(cè)定無(wú)影響。

正交設(shè)計(jì)優(yōu)化葛根素脂質(zhì)體的制備處方，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最優(yōu)處方為：大豆卵磷脂∶膽固醇＝2∶1（m∶m），大豆卵磷脂∶葛根素＝12∶1（m∶m），葛根素脂質(zhì)體包封率為 64.7%。初步穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制劑在4℃和25℃環(huán)境下，3個(gè)月內(nèi)外觀和包封率無(wú)明顯變化；40℃環(huán)境下，第2個(gè)月開始包封率有所下降；60℃時(shí)，第1個(gè)月包封率即明顯下降，制劑也開始發(fā)黃變黏。因此，制劑應(yīng)盡量低溫保存。

該項(xiàng)研究可為如何提高葛根素的生物利用度和體內(nèi)靶向作用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，為該制劑的開發(fā)提供借鑒。

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