四關(guān)穴埋線對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和腦海馬AchE、Ach的影響*

楊進(jìn)廉茍春雁田豐瑋楊智

（1.重慶市中醫(yī)院，重慶400021；2.重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院，重慶402360）

阿爾茨海默?。ˋD）發(fā)病率高，是當(dāng)今神經(jīng)疾病中研究的難點(diǎn)與熱點(diǎn)。目前臨床研究證明針刺治療老年性癡呆有確效，但對(duì)于中晚期老年癡呆的治療療效卻均不理想。穴位埋線治療和預(yù)防老年性癡呆療效較好，但報(bào)道不多，對(duì)其治療機(jī)理更是鮮有研究。本實(shí)驗(yàn)對(duì)AD的治療作用和機(jī)制進(jìn)行了研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，18月齡，清潔級(jí)，體質(zhì)量450～550 g，雌雄各半，許可證號(hào)：SCXK（川）2008-11，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性馴養(yǎng)1周，雌雄分籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑D-半乳糖（上海伯奧生物科技有限公司，批號(hào)20100217），氯化鋁（成都科龍化工試劑廠，批號(hào)20090712），AchE檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20110626），Ach檢測(cè)試劑盒（ELISA法）產(chǎn)自RD公司，批號(hào)20110705。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器通道式水迷宮：由無(wú)色有機(jī)玻璃制成，水深0.4 m，水溫控制在22～25℃之間。本裝置共設(shè)4個(gè)盲端，終點(diǎn)有臺(tái)階，動(dòng)物可通過(guò)臺(tái)階上岸躲避溺水威脅，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所研制。酶標(biāo)儀（法國(guó)西蒙公司），低溫離心機(jī)（美國(guó)貝克曼公司），Varioskan Flash全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 參照文獻(xiàn)［1］以D-半乳糖和AlCl3制備老年癡呆動(dòng)物模型。取18月齡SD大鼠48只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、針刺組、穴位埋線組，每組12只。除空白對(duì)照組外其余各組動(dòng)物均腹腔注射D-半乳糖48 mg/kg，同時(shí)灌胃2%AlCl3水溶液2 mL/只，每日1次，連續(xù)30 d，空白對(duì)照組采用等體積生理鹽水腹腔注射和灌胃。在造模的同時(shí)開始治療。穴位埋線組選用“四關(guān)穴”（即雙合谷、雙太沖），取穴標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［2］中大鼠穴位定位標(biāo)準(zhǔn)。使用三角針埋線法的改良方法 ，采用30號(hào)紫色醫(yī)用羊腸線，讓帶線的針前后貫通該穴，埋入大鼠體內(nèi)約2～3 mm，剪斷兩頭斷端方法 埋線，每10日埋線1次，連續(xù)3次。針刺治療組選用“四關(guān)穴”，以30號(hào)1寸不銹鋼毫針斜刺，刺入0.2寸，然后連接電針儀（型號(hào)G-6805，上海產(chǎn)），采用疏密波，頻率80～100 Hz，大小以大鼠能承受為度，20 min后出針。電針治療均于每日上午9時(shí)～11時(shí)進(jìn)行，20 min/次，每日1次，連續(xù)治療30 d。造模25 d后進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練，訓(xùn)練前將大鼠置于終點(diǎn)附近，讓其自行爬臺(tái)2次。訓(xùn)練時(shí)將大鼠放在起點(diǎn)后，記錄其進(jìn)入盲端的次數(shù)（錯(cuò)誤次數(shù)）及到達(dá)終點(diǎn)所需的時(shí)間（游出時(shí)間）。每次完成后休息1 min，每只大鼠每天訓(xùn)練10次。訓(xùn)練第1日路徑包括2個(gè)盲端，第2日包括3個(gè)盲端，第3日、4日、5日均為4個(gè)盲端，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以第5日為準(zhǔn)。設(shè)定總時(shí)間為3 min，超過(guò)3 min不能游出者按3 min計(jì)。以進(jìn)入盲端次數(shù)、到達(dá)終點(diǎn)所需時(shí)間來(lái)衡量大鼠學(xué)習(xí)、記憶的能力。完成水迷宮實(shí)驗(yàn)后，斷頭處死大鼠，取出大腦，在冰浴下分離出海馬組織，稱重，冰浴下超聲勻漿，制成10%勻漿液，3000 rpm低溫離心10 min，取上清液，按試劑盒說(shuō)明書方法 檢測(cè)乙酰膽堿酯酶（AchE）和乙酰膽堿（Ach）。

2 結(jié)果

相較空白對(duì)照組，模型組大鼠精神狀態(tài)差，動(dòng)作遲緩，進(jìn)食減少。針刺組和穴位埋線組大鼠較模型組有一定的改善。實(shí)驗(yàn)期間模型組死亡1只，針刺組死亡2只。

2.1 各組水迷宮測(cè)試結(jié)果 比較動(dòng)物在水迷宮游出時(shí)間越短、錯(cuò)誤次數(shù)越少，反映動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)。由表1可知，空白對(duì)照組的游出時(shí)間和錯(cuò)誤次數(shù)顯著低于模型對(duì)照組（P＜0.01），表明模型對(duì)照組動(dòng)物學(xué)習(xí)和記憶能力下降。與模型組相比，針刺組和穴位埋線組游出時(shí)間和錯(cuò)誤次數(shù)顯著降低（P＜0.05或0.01），表明針刺和穴位埋線治療能提高AD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。

表1 針刺和穴位埋線治療對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響（±s）

表1 針刺和穴位埋線治療對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響（±s）

與模型組相比，*P＜0.05；**P＜0.01；與對(duì)照組比較，△P＜0.05；△△P＜0.01。下同。

組別n游出時(shí)間（秒）錯(cuò)誤次數(shù)（次）空白組1217.34±8.26**2.04±1.33**模型組1157.29±18.13△△5.84±1.81△△針刺組1040.31±16.42*△△4.27±1.26*△穴位埋線組1238.76±19.13*△△4.09±1.76*△

2.2 各組大鼠腦海馬組織Ach和AchE水平比較見表2。由表2可知，模型組大鼠腦海馬組織AchE活性顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），Ach含量顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.01），表明AD大鼠腦海馬組織AchE活性升高而Ach含量下降。與模型組相比，針刺組和穴位埋線組腦海馬組織AchE活性雖有降低作用趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），Ach含量均顯著高于模型對(duì)照組（P＜0.05），表明針刺和穴位埋線治療對(duì)AD大鼠腦海馬組織AchE活性無(wú)明顯影響，但能明顯提高Ach含量。

表2 針刺和穴位埋線治療對(duì)AD大鼠腦內(nèi)Ach和AchE的影響（±s）

表2 針刺和穴位埋線治療對(duì)AD大鼠腦內(nèi)Ach和AchE的影響（±s）

組別nAchE（U/g）Ach（pmol/g）空白組1245.62±14.95**1.95±0.23**模型組1186.84±32.81△△0.88±0.22△△針刺組1069.47±22.26△1.23±0.37△△*穴位埋線組1271.34±31.96△1.14±0.30△△*

3 討論

目前治療AD方法 多樣，手段頻出，但對(duì)于中晚期癡呆的治療療效均不太理想，這就為臨床早期治療及預(yù)防AD提出了要求。埋穴療法利用其特殊的針具與所埋之羊腸線，產(chǎn)生了較一般針刺方法 更為強(qiáng)烈的針刺效應(yīng)，有“制其神，令其易行”和“通其經(jīng)脈，調(diào)其氣血”的作用，且治療一次持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，約2～4周。能方便臨床開展早期防治［3-4］。

本實(shí)驗(yàn)采用衰老和鋁中毒的多因素?fù)p害制備AD模型，更貼近AD繁雜的病因和病理變化過(guò)程，在這種模型上研究針刺和穴位埋線的治療作用及機(jī)理更加可靠?，F(xiàn)代研究表明，AD腦內(nèi)Ach含量減少，AchE活性升高，學(xué)習(xí)和記憶能力明顯下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表明，與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力明顯下降，腦海馬組織的Ach明顯降低，AchE活性明顯升高。同時(shí)提示，Ach減少程度與學(xué)習(xí)記憶障礙的嚴(yán)重性呈一定的正相關(guān)，這與文獻(xiàn)報(bào)道相符［5-6］。而針刺、穴位埋線治療可明顯提高AD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，提高腦海馬組織Ach含量，但對(duì)AchE影響不明顯。這證實(shí)了針刺和穴位埋線治療能改善中樞膽堿能功能。依據(jù)本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果 ，兩者治療效果相仿且治療機(jī)理可能與激活中樞膽堿能功能有關(guān)。

［1］ 董洪濤，房恭.多因素AD動(dòng)物模型的建立及針刺對(duì)其學(xué)習(xí)記憶功能的影響［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2002，36（5）：43.

［2］ 余曙光，郭義.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)［M］.5版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2009：22-24.

［3］ 任曉艷.穴位埋線的源流及其機(jī)理探討［J］.中國(guó)醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2004，19（12）：759.

［4］ 曾憲鋒.針刺“四關(guān)穴”對(duì)老年癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)能力影響的研究［J］.武警醫(yī)學(xué)，2008，19（9）：781.

［5］ 程海英，程?hào)|旗.針灸治療老年癡呆癥的研究進(jìn)展［J］.北京中醫(yī)，2006，25（5）：298.

［6］ 李前，朱振霞，孫曼霽.乙酰膽堿酯酶與老年性癡呆關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2002，22（4）：325.