• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    CHO細(xì)胞中通過(guò)基因過(guò)表達(dá)提高治療性蛋白產(chǎn)量的策略

    2020-02-18 17:41:27韓倩倩張?zhí)m蘭吳朋飛馬冰冰馬騰飛徐昌志張部昌
    生物學(xué)雜志 2020年1期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞周期抗體產(chǎn)量

    周 琴,韓倩倩,張?zhí)m蘭 ,吳朋飛,馬冰冰,馬騰飛,徐昌志,張部昌

    (1. 安徽大學(xué) 物質(zhì)科學(xué)與信息技術(shù)研究院,合肥 230601; 2. 安徽天祥糧油食品有限公司,阜陽(yáng) 236300)

    治療性蛋白在病毒感染、自身免疫疾病、臨床惡性腫瘤等治療方面取得了顯著療效,其中抗體藥物占比居多。自從1986年第一個(gè)治療性抗體進(jìn)入臨床以來(lái),抗體藥物行業(yè)得到了迅猛發(fā)展。截至2017年上半年,全球抗體藥物市場(chǎng)規(guī)模已達(dá)到490億美元,國(guó)外市場(chǎng)容量快速攀升,同時(shí)國(guó)內(nèi)抗體藥物市場(chǎng)規(guī)模也在逐年遞增[1]。用于重組蛋白生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括人胚胎腎細(xì)胞HEK293、人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞PERC6、非洲綠猴腎細(xì)胞COS-7、小鼠骨髓瘤細(xì)胞NSO和SP2/0和CHO細(xì)胞等。其中,近70%的重組蛋白藥物是由CHO細(xì)胞生產(chǎn)的[2],這主要得益于以下幾點(diǎn):1)具有與人相似的翻譯后修飾功能;2)FDA監(jiān)管機(jī)構(gòu)的認(rèn)可以及清晰的歷史背景;3)內(nèi)源性蛋白分泌極少;4)很容易在化學(xué)定義的無(wú)血清培養(yǎng)基中適應(yīng)高密度懸浮生長(zhǎng);5)比其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞系更不容易感染病毒;6)利用二氫葉酸還原酶(Dihydrofolate reductase, DHFR)和谷氨酰氨合成酶(Glutamine synthetase, GS)基因擴(kuò)增系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行篩選,有利于外源基因的表達(dá)。該細(xì)胞可塑性好,易于改造并能高效表達(dá)外源蛋白,已用于生長(zhǎng)激素、促紅細(xì)胞生成素、組織活化遺傳因子、凝血因子等生物蛋白的生產(chǎn)。

    如今,CHO細(xì)胞已成為重組蛋白制造業(yè)的首選宿主。CHO細(xì)胞工廠穩(wěn)定性的改善仍是滿足日益增長(zhǎng)的治療性蛋白質(zhì)需求的關(guān)鍵挑戰(zhàn),在重組蛋白的生產(chǎn)過(guò)程中還有許多限速步驟仍有待解決,需要開(kāi)發(fā)和采用新的策略來(lái)實(shí)現(xiàn)高效的哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)過(guò)程。通過(guò)傳統(tǒng)方法優(yōu)化培養(yǎng)工藝和培養(yǎng)基,可提高細(xì)胞增殖或最大可存活細(xì)胞密度(Viable cell density,VCD)[3]。此外,通過(guò)基因工程方法提高CHO工程細(xì)胞株的性能也經(jīng)過(guò)大量的細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)得以實(shí)現(xiàn)并成功應(yīng)用[4]。這些方法包含了過(guò)表達(dá)有利基因通過(guò)敲除或siRNA/shRNA介導(dǎo)的敲低作用對(duì)不利基因產(chǎn)物進(jìn)行抑制等方法。其中過(guò)表達(dá)技術(shù)操作簡(jiǎn)單易行,副作用較低,是一種高效的基因工程改造手段。該方法的基本步驟包括:1)將有益的功能基因穩(wěn)定地整合到基因組上;2)從多克隆池里分出單克隆細(xì)胞,從而獲得表達(dá)高而穩(wěn)定的工程細(xì)胞。

    1 控制細(xì)胞的增殖和死亡

    1.1 過(guò)表達(dá)促進(jìn)增殖相關(guān)基因

    在生物加工過(guò)程中,細(xì)胞特異性的生產(chǎn)力降低通常與細(xì)胞增殖加快導(dǎo)致的生長(zhǎng)周期縮短有關(guān)。生產(chǎn)階段的延長(zhǎng)促進(jìn)了細(xì)胞生物量的快速累積,而生產(chǎn)階段的特點(diǎn)是細(xì)胞特異性生產(chǎn)力的提高。結(jié)合這個(gè)理論,Doolan等[5]比較了生長(zhǎng)快慢不同的兩種CHO工程細(xì)胞株,采用基因芯片和蛋白質(zhì)組學(xué)分析得出含纈酪肽蛋白(Valosin-containing protein, VCP)對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)和存活率具有重大影響,過(guò)表達(dá)VCP最終使得細(xì)胞的存活密度提高了20%~30%。Lin等[6]通過(guò)過(guò)表達(dá)絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員Serpinb1,VCD和IgG單位體積產(chǎn)量分別提高了1.3倍和2.0倍。Darrin和Mohamed[7]在CHO細(xì)胞中過(guò)表達(dá)促細(xì)胞分裂癌基因c-myc,結(jié)果在沒(méi)有額外的營(yíng)養(yǎng)供給條件下將VCD提高了近70%。Mahameed和Tirosh[8]結(jié)合定向進(jìn)化的理論,證明過(guò)表達(dá)突變型酪氨酸激酶受體KIT(D816V)能夠賦予細(xì)胞高度的增殖能力和對(duì)激酶抑制劑的抵抗能力。工業(yè)生產(chǎn)常常受到培養(yǎng)后期細(xì)胞增殖太快和營(yíng)養(yǎng)限制的約束,因此采用流加培養(yǎng)的工藝會(huì)延長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)周期,但是由此帶來(lái)的成本很高。通過(guò)過(guò)表達(dá)促進(jìn)增殖相關(guān)基因使細(xì)胞在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到最大活細(xì)胞密度從而提高產(chǎn)量不失為一種高效低成本的手段。

    1.2 過(guò)表達(dá)抗凋亡相關(guān)基因

    克服凋亡來(lái)提高細(xì)胞生產(chǎn)能力是有效生產(chǎn)治療蛋白廣泛應(yīng)用的策略之一[9]。通過(guò)建立過(guò)表達(dá)抗凋亡基因的穩(wěn)定細(xì)胞系,使細(xì)胞對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性增強(qiáng),可以提高重組蛋白的產(chǎn)量[10]。Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染抗凋亡基因Bcl-x的CHO細(xì)胞中,抗PD1抗體的總產(chǎn)量增加約82%,在轉(zhuǎn)染抗凋亡基因Mcl-1的CHO細(xì)胞中,抗體總產(chǎn)量增加34%。Sauerwald 等[12]證明過(guò)表達(dá)X-連鎖凋亡抑制劑(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)可促進(jìn)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)和延長(zhǎng)培養(yǎng)壽命,同時(shí)可提高生產(chǎn)力。Majors等[13]通過(guò)表達(dá)一種突變的Bcl-XL基因,可以提高CHO細(xì)胞的抗凋亡能力。研究人員還利用其他抗凋亡基因如B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、凋亡抑制基因Aven、Fas凋亡途徑抑制分子(Fas apoptotic inhibitory molecule, FAIM)等來(lái)抑制凋亡[14]。最新報(bào)道指出,在促凋亡條件下,外泌體增強(qiáng)了細(xì)胞的活性。由于外泌體來(lái)源于CHO細(xì)胞本身,因此抑制細(xì)胞凋亡不僅有利于提高CHO細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)力,還能減少安全顧慮[15]。綜上,為了使細(xì)胞適應(yīng)工業(yè)化長(zhǎng)期大規(guī)模培養(yǎng),過(guò)表達(dá)抗凋亡基因能夠有效提高細(xì)胞的抗凋亡能力,進(jìn)而提高重組蛋白的產(chǎn)量,但是與此帶來(lái)的細(xì)胞株篩選困難也會(huì)隨之增加。

    1.3 過(guò)表達(dá)自噬相關(guān)基因

    自噬能使哺乳動(dòng)物細(xì)胞通過(guò)自身細(xì)胞器和其他細(xì)胞成分降解而產(chǎn)生能量,在生產(chǎn)過(guò)程中,饑餓條件也會(huì)誘導(dǎo)CHO細(xì)胞自噬[16]。CHO細(xì)胞工程可以同時(shí)靶向自噬和凋亡途徑,已經(jīng)有報(bào)道過(guò)表達(dá)AKT、Bcl-XL或者共表達(dá)Bcl-2和Beclin1來(lái)減緩自噬,延長(zhǎng)培養(yǎng)壽命[17-19]。然而,僅僅通過(guò)過(guò)表達(dá)自噬通路基因ATG9A的方法來(lái)單純調(diào)節(jié)自噬的策略無(wú)法影響自噬,因此這些手段并沒(méi)有增加CHO細(xì)胞中的治療性蛋白產(chǎn)量[20]。充分了解其分子基礎(chǔ),還有待深入研究,并最終有助于發(fā)現(xiàn)適合利用細(xì)胞工程改造的自噬相關(guān)基因。

    1.4 過(guò)表達(dá)阻滯細(xì)胞周期相關(guān)基因

    將細(xì)胞周期阻滯在G1期能夠帶來(lái)普遍產(chǎn)量提高的功效[21]。細(xì)胞周期阻滯與細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑、細(xì)胞周期素依賴性激酶以及細(xì)胞周期素有關(guān)[22]。基于這一點(diǎn),Pratik等[23]證明共過(guò)表達(dá)細(xì)胞周期依賴性激酶3(Cyclin-dependent kinases 3, CDK3)和細(xì)胞色素c氧化酶第15亞基(Cytochrome oxidase 15, COX15)可增加活細(xì)胞密度。Meents等[24]將p27KIP1和p21CIP1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)生產(chǎn)分泌型堿性磷酸酶(Secreted alkaline phosphatase, SEAP)的工程CHO細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)量的提高。Carvalhal等[25]研究證明p21CIP1過(guò)表達(dá)可以抑制細(xì)胞周期和生長(zhǎng),提高生產(chǎn)力,同時(shí)增加線粒體和核糖體的細(xì)胞體積和生物發(fā)生量。Lee等[26]通過(guò)過(guò)表達(dá)野生型和突變型CHO細(xì)胞周期調(diào)控因子(Cell division cycle 25A, CDC25A),發(fā)現(xiàn)突變的CDC25A過(guò)表達(dá)克隆表現(xiàn)比野生型高約20%的比生產(chǎn)率。過(guò)表達(dá)阻滯細(xì)胞周期的基因顯著抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng),加大了細(xì)胞株篩選工作的困難,但是能顯著提高產(chǎn)量,這可能與代謝消耗的增加伴隨著氧氣、谷氨酰胺、葡萄糖和胞內(nèi)AMP/ADP/ATP的消耗有關(guān)。

    2 控制細(xì)胞的代謝和分泌

    2.1 過(guò)表達(dá)提高代謝相關(guān)基因

    CHO細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中氨和乳酸的積累對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)品質(zhì)量有不利的影響。調(diào)控參與細(xì)胞代謝基因的表達(dá)是提高CHO生產(chǎn)細(xì)胞性能的重要手段。為了減少谷氨酰胺產(chǎn)生的氨,Zhang等[27]構(gòu)建了一種重組CHO細(xì)胞表達(dá)谷氨酰胺合成酶來(lái)催化谷氨酸和氨生成谷氨酰胺,使得重組蛋白產(chǎn)量提高了18%。乳酸是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中重要的代謝產(chǎn)物之一,高乳酸水平是由高氧糖酵解引起的,也稱為沃伯格效應(yīng),并通常與不良的培養(yǎng)性能有關(guān),因此,為提高生長(zhǎng)、生產(chǎn)力和加工穩(wěn)健性,減少乳酸的積累已成為細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展中的一個(gè)持續(xù)挑戰(zhàn)[28]。改變與丙酮酸代謝途徑有關(guān)的幾種遺傳調(diào)控策略也多次被報(bào)道,Chong等[29]在代謝學(xué)的研究中證明了過(guò)表達(dá)蘋果酸脫氫酶Ⅱ(Malate dehydrogenase, MDHⅡ)使得整體存活細(xì)胞數(shù)提高了1.9倍。Tabuchi等[30-31]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)牛磺酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或者共表達(dá)?;撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶均能將CHO細(xì)胞的產(chǎn)抗能力提高到47%以上。因此,過(guò)表達(dá)代謝相關(guān)基因可以有效提高細(xì)胞面對(duì)代謝廢物等的抗壓能力,從而提高產(chǎn)量。

    2.2 過(guò)表達(dá)促進(jìn)分泌相關(guān)基因

    在CHO工程細(xì)胞中穩(wěn)定插入基因來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞蛋白的生物合成量或者分泌功能可以顯著提高治療性蛋白的產(chǎn)量。例如過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子4(Activating transcription factor 4,ATF4)、DNA損害可誘導(dǎo)蛋白34(Growth arrest and DNA damage inducible gene 34, GADD34)可以將重組人抗凝血酶III(Antithrombin III, AT-III)的產(chǎn)量提高1.4~2倍[32-33]。在一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)單克隆抗體的CHO細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子YY1也能將產(chǎn)量提高6倍[34]。這種正效應(yīng)導(dǎo)致的產(chǎn)量提高被證明是轉(zhuǎn)錄后的翻譯修飾及分泌功能加強(qiáng)所引起的。隨著一些復(fù)雜、難表達(dá)的治療性蛋白的需求量增加,一些策略也已經(jīng)慢慢開(kāi)始被開(kāi)發(fā)出來(lái),為臨床研究和市場(chǎng)供應(yīng)提供一些素材。Pybus等[35]報(bào)道了共表達(dá)免疫球蛋白結(jié)合蛋白(Immunoglobulin binding protein, BIP)、激活轉(zhuǎn)錄因子6C(Activating transcription factor 6C, ATF6C)和X-Box結(jié)合蛋白1(X-Box binding protein 1, XBP1)可以提高CHO細(xì)胞對(duì)一些難表達(dá)抗體的表達(dá)能力。Le等[36]還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)策略來(lái)克服難表達(dá)治療性蛋白的局限性,他們通過(guò)過(guò)表達(dá)人信號(hào)受體蛋白14(Signal receptor protein 14, SRP14)來(lái)提高細(xì)胞的分泌能力。科學(xué)家們進(jìn)一步利用基因編輯技術(shù)來(lái)探索靶向分泌途徑的各種不同基因,從而提高治療性蛋白的分泌。例如過(guò)表達(dá)蛋白二硫化物異構(gòu)酶(Protein disulfide isomerase, PDI)[37]、神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Ceramide transfer protein, CERT)[38]、突觸小體相關(guān)蛋白23(Synaptosomes-associated protein of 23 ku, SNAP-23)[39]等都被證明可以提高治療性蛋白的產(chǎn)量。因此,過(guò)表達(dá)促進(jìn)分泌相關(guān)的基因能夠顯著提高一些難表達(dá)蛋白的產(chǎn)量。

    3 控制細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄后翻譯

    針對(duì)某一個(gè)基因進(jìn)行編輯存在一定的局限性,也有一些研究同時(shí)過(guò)表達(dá)兩個(gè)基因[11, 17],但同時(shí)過(guò)表達(dá)兩個(gè),甚至超過(guò)兩個(gè)基因時(shí)會(huì)過(guò)多占用細(xì)胞翻譯資源,從而限制了重組蛋白產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。篩選并應(yīng)用具有多種功能的潛在分子成為一種研究方向。同時(shí),近些年小分子RNA的研究成為熱點(diǎn)[40-42]。因?yàn)樾》肿覴NA不占用細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯資源,不會(huì)給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過(guò)度施加壓力,并且能夠靶向多個(gè)基因,達(dá)到同時(shí)編輯多個(gè)效應(yīng)基因的效果,成為一種高效的基因工程手段。例如過(guò)表達(dá)miRNA-17、miRNA-2861、miRNA-1287、miRNA-483等均能夠有效提高重組蛋白的產(chǎn)量[43-46];過(guò)表達(dá)miRNA-557可以使難表達(dá)蛋白的效價(jià)提高兩倍以上[47];過(guò)表達(dá)整個(gè)miR-30家族均能增強(qiáng)CHO細(xì)胞中的重組蛋白生產(chǎn)[48];過(guò)表達(dá)miRNA-143靶向有絲分裂原激活蛋白激酶7(Mitogen-activated protein kinase, MAPK7) 來(lái)顯著提高蛋白產(chǎn)量,而不會(huì)對(duì)重組CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活率產(chǎn)生負(fù)面影響[49]。與此同時(shí),該方法也存在一定缺陷,正因?yàn)樾》肿覴NA的靶點(diǎn)多,副作用不明確,因此關(guān)于過(guò)表達(dá)miRNA方向的研究還有待進(jìn)一步挖掘。

    4 控制細(xì)胞對(duì)抗體的糖基化修飾

    雖然由CHO細(xì)胞產(chǎn)生的治療性重組蛋白通常被認(rèn)為是安全的,可以用于人類疾病治療,但是人們認(rèn)為其表現(xiàn)出的與人類類似但并不相同的翻譯后修飾還不足夠充分[50],因此在CHO細(xì)胞中已經(jīng)采用不同的基因工程方法來(lái)修飾生產(chǎn)出來(lái)的重組蛋白的糖基化模式[51]。和人源、鼠源細(xì)胞相比,CHO不能表達(dá)半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase, α-2,6(ST6GAL)),只能表達(dá)半乳糖苷唾液酸轉(zhuǎn)移酶(Beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase, α-2,3(ST3GAL)),因此CHO細(xì)胞本身就不能產(chǎn)生具有相似末端唾液酸含量的糖蛋白[52]。Fukuta等[53]通過(guò)過(guò)表達(dá)N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅲ(N- acetylglucosaminyltransferase III, GnTⅢ)證明改善GLCNAC殘基的糖鏈比例對(duì)治療有積極作用。Jassal等[54]證明在CHO細(xì)胞中過(guò)表達(dá)不同物種(人類、倉(cāng)鼠、小鼠)的ST6GAL可以增強(qiáng)重組蛋白N端唾液酸糖基化修飾。

    5 結(jié)語(yǔ)

    近20年來(lái),基因工程已成為CHO細(xì)胞生物學(xué)中一門強(qiáng)大而多功能的學(xué)科。迄今為止,在最大存活細(xì)胞密度和產(chǎn)量方面的非凡進(jìn)展,很大一部分歸功于基因過(guò)表達(dá)策略在CHO細(xì)胞工程中的應(yīng)用。以上對(duì)過(guò)表達(dá)不同的基因進(jìn)行了概述,其中過(guò)表達(dá)促進(jìn)增殖相關(guān)基因能夠在快速培養(yǎng)模式下,以最短時(shí)間達(dá)到最大VCD從而實(shí)現(xiàn)重組蛋白的快速生產(chǎn);而過(guò)表達(dá)抗凋亡基因在工業(yè)大規(guī)模持續(xù)培養(yǎng)的模式下是提高產(chǎn)量最普遍、最常用的一種策略,但是也存在一定缺陷,例如細(xì)胞的增殖緩慢,細(xì)胞株的篩選周期較長(zhǎng);過(guò)表達(dá)與自噬相關(guān)基因也能提高重組蛋白的產(chǎn)量,但是自噬不是最主要的死亡形式,因此其應(yīng)用存在一定局限性;過(guò)表達(dá)阻滯細(xì)胞周期相關(guān)基因?qū)Ξa(chǎn)量的影響目前存在爭(zhēng)議,表現(xiàn)為明顯的生長(zhǎng)抑制,與此同時(shí)增加了單克隆細(xì)胞株篩選的難度;對(duì)于一些難表達(dá)的治療性蛋白,過(guò)表達(dá)與代謝和分泌相關(guān)的基因可以明顯提高其產(chǎn)量;過(guò)表達(dá)與糖基化修飾相關(guān)的基因是提高完整型IgG形式的一個(gè)途徑。為實(shí)現(xiàn)同時(shí)改變細(xì)胞的多種功能,同時(shí)過(guò)表達(dá)多個(gè)基因也能夠改善細(xì)胞性能從而提高產(chǎn)量,但是會(huì)引入過(guò)多的抗性基因,占用細(xì)胞內(nèi)翻譯資源。因此,篩選具有多種功能的單個(gè)基因成為研究的熱點(diǎn)。新的研究方向主要為兩方面:1)以腫瘤進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生的定向突變基因作為靶點(diǎn);2)近年來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn)非編碼RNA在CHO細(xì)胞中發(fā)揮顯著作用,miRNA工程以及其他非編碼RNA如circRNA、link RNA、 lncRNA等還有很大的探索空間,未來(lái)將進(jìn)一步拓展CHO細(xì)胞工程涉及的過(guò)表達(dá)基因的靶點(diǎn)范圍。

    猜你喜歡
    細(xì)胞周期抗體產(chǎn)量
    2022年11月份我國(guó)鋅產(chǎn)量同比增長(zhǎng)2.9% 鉛產(chǎn)量同比增長(zhǎng)5.6%
    今年前7個(gè)月北海道魚(yú)糜產(chǎn)量同比減少37%
    海水稻產(chǎn)量測(cè)評(píng)平均產(chǎn)量逐年遞增
    紅霉素聯(lián)合順鉑對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡的影響
    2018上半年我國(guó)PVC產(chǎn)量數(shù)據(jù)
    聚氯乙烯(2018年9期)2018-02-18 01:11:34
    抗BP5-KLH多克隆抗體的制備及鑒定
    NSCLC survivin表達(dá)特點(diǎn)及其與細(xì)胞周期的關(guān)系研究
    X線照射劑量率對(duì)A549肺癌細(xì)胞周期的影響
    熊果酸對(duì)肺癌細(xì)胞株A549及SPCA1細(xì)胞周期的抑制作用
    乙肝抗體從哪兒來(lái)
    肝博士(2015年2期)2015-02-27 10:49:44
    嫩草影院精品99| 成年女人毛片免费观看观看9| 脱女人内裤的视频| 在线观看www视频免费| 日韩精品免费视频一区二区三区| 天天添夜夜摸| 亚洲一码二码三码区别大吗| 色综合站精品国产| 欧美不卡视频在线免费观看 | 在线观看舔阴道视频| 亚洲在线自拍视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 色播在线永久视频| 又黄又粗又硬又大视频| 手机成人av网站| 国产午夜福利久久久久久| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 午夜福利18| 男人舔女人下体高潮全视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久久久久大精品| 一级片免费观看大全| 午夜福利视频1000在线观看 | 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 国产片内射在线| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 热re99久久国产66热| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 757午夜福利合集在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 一区二区三区激情视频| 波多野结衣高清无吗| 99re在线观看精品视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲人成77777在线视频| 欧美在线一区亚洲| 可以在线观看的亚洲视频| 成人亚洲精品av一区二区| 日韩欧美在线二视频| 日韩国内少妇激情av| 日本五十路高清| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 可以免费在线观看a视频的电影网站| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久人人97超碰香蕉20202| 免费搜索国产男女视频| 两人在一起打扑克的视频| 看黄色毛片网站| 女同久久另类99精品国产91| 欧美黑人欧美精品刺激| 黄色片一级片一级黄色片| 中文字幕av电影在线播放| 午夜福利高清视频| 亚洲精品美女久久av网站| 一区二区三区精品91| 制服人妻中文乱码| 久久香蕉精品热| 他把我摸到了高潮在线观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 人人澡人人妻人| 亚洲电影在线观看av| 亚洲激情在线av| 视频在线观看一区二区三区| 黄色a级毛片大全视频| 动漫黄色视频在线观看| 国产一区二区激情短视频| 国产国语露脸激情在线看| 国产精品野战在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 9191精品国产免费久久| 国产野战对白在线观看| 69av精品久久久久久| 国产亚洲欧美精品永久| 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美日本中文国产一区发布| 很黄的视频免费| 精品卡一卡二卡四卡免费| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 久热爱精品视频在线9| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 最近最新免费中文字幕在线| 久久伊人香网站| 97人妻天天添夜夜摸| 久热这里只有精品99| 母亲3免费完整高清在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 在线观看66精品国产| 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲熟妇熟女久久| 一级作爱视频免费观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产精品久久久av美女十八| 丝袜人妻中文字幕| 欧美久久黑人一区二区| 午夜免费成人在线视频| 电影成人av| 国产人伦9x9x在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 成在线人永久免费视频| 亚洲avbb在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 中文字幕精品免费在线观看视频| 91麻豆精品激情在线观看国产| 午夜福利视频1000在线观看 | 两个人视频免费观看高清| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 在线观看66精品国产| 精品乱码久久久久久99久播| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲av成人一区二区三| 国产高清激情床上av| 久久精品成人免费网站| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产av一区在线观看免费| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 桃色一区二区三区在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 天天添夜夜摸| 级片在线观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲第一电影网av| 色哟哟哟哟哟哟| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产野战对白在线观看| 一区二区三区精品91| 国产1区2区3区精品| av中文乱码字幕在线| 午夜亚洲福利在线播放| 久久伊人香网站| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 日本a在线网址| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲电影在线观看av| 国产亚洲欧美在线一区二区| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲色图av天堂| 免费在线观看完整版高清| 久9热在线精品视频| 精品国产国语对白av| 国产在线观看jvid| 香蕉国产在线看| 精品高清国产在线一区| 在线永久观看黄色视频| x7x7x7水蜜桃| 精品不卡国产一区二区三区| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲av熟女| 国产av一区在线观看免费| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲av成人av| 欧美成人免费av一区二区三区| 一级黄色大片毛片| 成在线人永久免费视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久婷婷成人综合色麻豆| 俄罗斯特黄特色一大片| 91老司机精品| 一级a爱片免费观看的视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 91精品国产国语对白视频| 色在线成人网| 日本 欧美在线| 国内精品久久久久精免费| 久久久久亚洲av毛片大全| 满18在线观看网站| 黄色毛片三级朝国网站| 国产主播在线观看一区二区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产免费男女视频| 亚洲第一青青草原| 性少妇av在线| 欧美不卡视频在线免费观看 | 99re在线观看精品视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲av电影在线进入| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 90打野战视频偷拍视频| 午夜福利成人在线免费观看| 妹子高潮喷水视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产午夜福利久久久久久| 国产精品av久久久久免费| 黄色丝袜av网址大全| 自线自在国产av| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 香蕉久久夜色| 精品国产美女av久久久久小说| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 香蕉丝袜av| 国产人伦9x9x在线观看| 国产又爽黄色视频| 热99re8久久精品国产| 国产精品98久久久久久宅男小说| 成在线人永久免费视频| 中文字幕久久专区| 少妇粗大呻吟视频| 精品国产美女av久久久久小说| 欧美日韩精品网址| 亚洲欧美激情在线| 此物有八面人人有两片| 丰满的人妻完整版| 亚洲av第一区精品v没综合| 可以在线观看的亚洲视频| 91老司机精品| 国产午夜福利久久久久久| 精品乱码久久久久久99久播| 在线观看免费日韩欧美大片| 精品国产乱子伦一区二区三区| 一区二区三区激情视频| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲人成电影观看| 欧美大码av| 精品国产亚洲在线| 在线永久观看黄色视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 午夜久久久久精精品| 在线观看www视频免费| 日韩三级视频一区二区三区| 免费在线观看黄色视频的| 国产精品野战在线观看| 黄片小视频在线播放| 最新在线观看一区二区三区| 大型黄色视频在线免费观看| 大香蕉久久成人网| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 日韩三级视频一区二区三区| 精品第一国产精品| 久久亚洲精品不卡| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 黄色 视频免费看| 满18在线观看网站| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧美激情 高清一区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 1024视频免费在线观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 欧美黑人欧美精品刺激| 色尼玛亚洲综合影院| 精品人妻1区二区| 两性夫妻黄色片| 激情在线观看视频在线高清| 日韩欧美免费精品| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲久久久国产精品| 国产亚洲欧美精品永久| 国产在线观看jvid| 欧美黄色淫秽网站| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美成人午夜精品| 亚洲五月天丁香| 在线观看舔阴道视频| 91精品三级在线观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 无遮挡黄片免费观看| 一区在线观看完整版| 国产精品1区2区在线观看.| 嫩草影院精品99| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 99久久精品国产亚洲精品| 不卡一级毛片| 国产成人影院久久av| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产精品精品国产色婷婷| 我的亚洲天堂| 免费在线观看完整版高清| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久人人97超碰香蕉20202| 午夜福利视频1000在线观看 | 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 亚洲三区欧美一区| 国产精品久久视频播放| 少妇熟女aⅴ在线视频| 日韩视频一区二区在线观看| 国产成人av激情在线播放| 黄色女人牲交| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲国产精品999在线| 女警被强在线播放| 亚洲全国av大片| 午夜福利视频1000在线观看 | 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲精品在线美女| 久久久久九九精品影院| 在线观看66精品国产| 两个人视频免费观看高清| 9191精品国产免费久久| 日韩视频一区二区在线观看| 国产亚洲精品av在线| 国产欧美日韩精品亚洲av| 高清在线国产一区| 久热这里只有精品99| 91麻豆av在线| 亚洲第一av免费看| 老司机福利观看| 无遮挡黄片免费观看| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲精品在线美女| 久久午夜亚洲精品久久| 色哟哟哟哟哟哟| 桃红色精品国产亚洲av| 在线观看www视频免费| 一边摸一边抽搐一进一小说| 九色亚洲精品在线播放| 电影成人av| 欧美激情久久久久久爽电影 | 一级黄色大片毛片| 在线观看午夜福利视频| 麻豆成人av在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久精品国产亚洲av高清一级| 香蕉久久夜色| 久久人妻熟女aⅴ| 午夜福利影视在线免费观看| 久久中文字幕一级| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产精品日韩av在线免费观看 | 免费观看人在逋| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 国产成年人精品一区二区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 在线观看www视频免费| 免费看十八禁软件| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久亚洲真实| 无限看片的www在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 在线国产一区二区在线| 一个人免费在线观看的高清视频| 一级毛片高清免费大全| 午夜福利免费观看在线| 热re99久久国产66热| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲国产精品合色在线| 麻豆一二三区av精品| 纯流量卡能插随身wifi吗| 欧美激情极品国产一区二区三区| 人妻久久中文字幕网| 老汉色∧v一级毛片| a级毛片在线看网站| 91九色精品人成在线观看| 久久精品影院6| 91大片在线观看| 欧美在线黄色| av片东京热男人的天堂| 动漫黄色视频在线观看| 欧美在线一区亚洲| 香蕉久久夜色| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲自拍偷在线| 禁无遮挡网站| 成人国产综合亚洲| 亚洲中文av在线| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 久久亚洲真实| 精品国产国语对白av| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产亚洲精品第一综合不卡| 99精品久久久久人妻精品| 国产乱人伦免费视频| 91av网站免费观看| 日日夜夜操网爽| 国产精品久久久久久精品电影 | 日韩高清综合在线| 搞女人的毛片| 久久久久久久午夜电影| 老司机午夜福利在线观看视频| 午夜视频精品福利| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 怎么达到女性高潮| 国产免费av片在线观看野外av| 两人在一起打扑克的视频| 在线观看www视频免费| 免费搜索国产男女视频| 在线观看舔阴道视频| 91精品三级在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 久久人人精品亚洲av| 久久久久九九精品影院| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 天天添夜夜摸| 怎么达到女性高潮| 国产xxxxx性猛交| 亚洲人成电影免费在线| 精品不卡国产一区二区三区| 久久人妻熟女aⅴ| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 免费人成视频x8x8入口观看| 色综合婷婷激情| 亚洲av美国av| 精品久久久久久成人av| 亚洲自拍偷在线| 一级作爱视频免费观看| 在线观看www视频免费| 69av精品久久久久久| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲av成人av| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| av欧美777| 亚洲免费av在线视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲中文av在线| 国产精品久久电影中文字幕| 日韩免费av在线播放| 午夜免费激情av| 亚洲最大成人中文| a级毛片在线看网站| 一区二区三区激情视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲少妇的诱惑av| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲成人国产一区在线观看| 免费看十八禁软件| 色哟哟哟哟哟哟| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 精品久久久久久,| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 宅男免费午夜| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 日本黄色视频三级网站网址| bbb黄色大片| 男女午夜视频在线观看| svipshipincom国产片| 99精品欧美一区二区三区四区| 真人做人爱边吃奶动态| 国产亚洲精品久久久久5区| 国语自产精品视频在线第100页| 禁无遮挡网站| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产成人精品久久二区二区免费| 51午夜福利影视在线观看| 欧美日韩精品网址| 国产熟女午夜一区二区三区| 涩涩av久久男人的天堂| 国产片内射在线| 久久久水蜜桃国产精品网| 欧美日本视频| 午夜福利在线观看吧| 亚洲精品国产区一区二| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产精品久久久人人做人人爽| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 亚洲色图av天堂| 午夜精品在线福利| 日韩免费av在线播放| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲视频免费观看视频| 波多野结衣巨乳人妻| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| av福利片在线| 国产精品久久久av美女十八| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲av五月六月丁香网| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产三级黄色录像| 少妇熟女aⅴ在线视频| 一区二区三区精品91| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| √禁漫天堂资源中文www| 天堂动漫精品| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 午夜福利在线观看吧| 999久久久国产精品视频| 狂野欧美激情性xxxx| 国产精品,欧美在线| 真人做人爱边吃奶动态| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 午夜福利成人在线免费观看| АⅤ资源中文在线天堂| 搞女人的毛片| 成年人黄色毛片网站| 久久人人精品亚洲av| 国产高清videossex| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲一区中文字幕在线| 一区在线观看完整版| 成人三级黄色视频| 九色国产91popny在线| 久久久国产精品麻豆| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 久久国产乱子伦精品免费另类| 欧美大码av| 成在线人永久免费视频| 久久香蕉精品热| 免费不卡黄色视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 精品久久久精品久久久| 又大又爽又粗| av天堂在线播放| 青草久久国产| 亚洲成人精品中文字幕电影| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产三级黄色录像| 国产精品99久久99久久久不卡| 女警被强在线播放| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 成人欧美大片| 欧美在线一区亚洲| 91字幕亚洲| 成人18禁在线播放| 日韩视频一区二区在线观看| 亚洲欧美激情在线| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久热这里只有精品99| 男男h啪啪无遮挡| 欧美在线一区亚洲| www.自偷自拍.com| 欧美大码av| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产99白浆流出| 欧美一级毛片孕妇| 黄色视频不卡| 亚洲色图av天堂| 午夜老司机福利片| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 在线国产一区二区在线| 99riav亚洲国产免费| 国产亚洲精品第一综合不卡| 91老司机精品| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲专区中文字幕在线| www.精华液| 午夜福利免费观看在线| 亚洲成人免费电影在线观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 十八禁网站免费在线| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 久99久视频精品免费| 在线观看免费视频网站a站| 中文字幕高清在线视频| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲国产精品sss在线观看| 午夜免费鲁丝| 国产高清有码在线观看视频 | 精品卡一卡二卡四卡免费| 一本久久中文字幕| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | www日本在线高清视频| 波多野结衣一区麻豆| 在线观看免费视频网站a站| 色综合婷婷激情| 黄片大片在线免费观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产精品野战在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲 欧美一区二区三区| 中亚洲国语对白在线视频| 神马国产精品三级电影在线观看 | 午夜成年电影在线免费观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 精品欧美一区二区三区在线| 日韩三级视频一区二区三区| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 宅男免费午夜| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 美女大奶头视频| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 啦啦啦 在线观看视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久狼人影院| 国产在线精品亚洲第一网站| 成在线人永久免费视频| 老司机靠b影院| 日韩欧美在线二视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 成人av一区二区三区在线看| 黄色丝袜av网址大全| 搡老妇女老女人老熟妇| 纯流量卡能插随身wifi吗| 日韩欧美国产在线观看| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲专区中文字幕在线| 九色国产91popny在线| 久久久久久久精品吃奶| 日韩欧美国产一区二区入口|