血清/血漿microRNAs作為肺癌診斷標(biāo)記物的研究進(jìn)展

張輝 綜述 陳曉峰 審校

近年來隨著肺癌發(fā)病率與死亡率的逐年上升，肺癌已成為最具有致命性的惡性腫瘤之一。據(jù)美國癌癥學(xué)會發(fā)布的一項數(shù)據(jù)顯示，2010年美國確診肺癌患者約22.2萬人，約15.7萬人死于肺癌，位居因惡性腫瘤死亡人數(shù)的首位[1]。在我國肺癌也已成為位居首位的癌癥死因[2]。在所有肺癌中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）約占85%[3]。雖然目前仍沒有非常有效的治療手段，但早期NSCLC的治療已取得較大的進(jìn)步，其中以手術(shù)為主的綜合治療可以明顯延長I期NSCLC患者的生存期，5年生存率達(dá)到45%-65%[3]。因此早期發(fā)現(xiàn)肺癌可以減少肺癌的死亡率，但是目前還沒有一種非常安全有效的方法對肺癌高危人群進(jìn)行篩查，以往的肺癌標(biāo)記物如細(xì)胞角蛋白21-1、腫瘤多糖、癌胚抗原診斷肺癌的敏感度較低[4]。有研究[5,6]報道影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)的肺部結(jié)節(jié)，大約50%是良性的，對減少肺癌死亡率作用有限。此外，超聲氣管內(nèi)鏡下活檢、肺穿刺活檢為有創(chuàng)檢查方式。

MicroRNAs（簡稱miRNAs）是一類高度保守、長度很短的非編碼調(diào)控單鏈RNA，約20 nt-24 nt，通過與目標(biāo)mRNA互補(bǔ)配對導(dǎo)致mRNA降解或抑制轉(zhuǎn)錄后翻譯誘導(dǎo)基因沉默[7]。MiRNA參與生命過程中一系列的重要進(jìn)程，包括發(fā)育、造血、器官形成、凋亡和細(xì)胞增殖，以及癌癥的發(fā)生、發(fā)展，其通過切割靶mRNA或抑制靶mRNA翻譯實現(xiàn)miRNAs抑制基因表達(dá)[8]。最近研究發(fā)現(xiàn)，血清/血漿中有大量穩(wěn)定存在的miRNA，并且可作為肺癌的診斷標(biāo)記物。

1 血清/血漿miRNA的穩(wěn)定性

在血清/血漿中存在大量的核糖核酸酶，那么miRNA是否可以逃脫核糖核酸酶的消化？對此Chen等[9]、Mitchell等[10]2008年報道血清中的miRNA可以耐受核糖核酸酶的消化。Ho等[11]報道血漿miRNA在100oC的環(huán)境下也可保持穩(wěn)定性。他們將血漿煮沸20 min后提取miRNA，然后測量miRNA的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)與對照組相比miRNA表達(dá)量沒有明顯變化。此外Taylor[12]、Huang[13]、Gilad[14]等報道在4oC和室溫下miRNA也可保持穩(wěn)定性。還有研究[9-11,14]報道m(xù)iRNA經(jīng)反復(fù)凍融和在強(qiáng)酸（pH=1）、強(qiáng)堿（pH=13）的環(huán)境中也可穩(wěn)定存在。

血清/血漿miRNA保持穩(wěn)定性的機(jī)制仍不清楚，目前主要有兩種觀點。一種觀點認(rèn)為分泌到血液中的miRNA是以被膜包繞的囊泡狀結(jié)構(gòu)存在的，被稱之為外核體（exosomes）或微泡（microvesicles），通過此結(jié)構(gòu)可以有效保護(hù)血清/血漿中的miRNA不被核糖核酸酶消化，并且可以將miRNA運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[15-17]。另一種觀點認(rèn)為血清/血漿miRNA以蛋白復(fù)合體的形式存在[18]。Arroyo等[19]報道，循環(huán)中的miRNA可以被蛋白酶破壞，失去穩(wěn)定性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Argonaute2（Ago2）蛋白在該復(fù)合體中起著重要作用，因此將循環(huán)中的miRNA稱之為Ago2-miRNA蛋白復(fù)合體。

目前關(guān)于血清/血漿miRNA的各種功能機(jī)制研究的仍比較少，關(guān)于血清/血漿miRNA是如何進(jìn)入血液、在血液中如何運(yùn)輸以及如何進(jìn)入靶細(xì)胞發(fā)揮作用仍不是很清楚，這一系列的問題需要進(jìn)一步的研究。

2 血清/血漿miRNA的檢測方法

目前許多研究[20-23]通常使用75 μL-1.5 mL的血清/血漿抽提miRNA。Kroh等[24]報道用400 μL的血清/血漿抽提miRNA，不僅方便操作，也可抽提出滿意的miRNA濃度。目前主要有兩種方法提取血清/血漿miRNA，一種是Trizol法，另一種是濾柱法。因Trizol中含有苯酚、異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞并抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶，并且能在破碎和溶解細(xì)胞時保持RNA的完整性，可以用于直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA。當(dāng)前使用最多的是濾柱法，在使用濾柱法時因血清/血漿中含有大量的蛋白質(zhì)，通常在抽提前需要使用苯酚-氯仿處理樣本，以去除蛋白質(zhì)，防止在抽提過程中大量蛋白阻塞濾柱而大量損耗miRNA。對于檢測miRNA的表達(dá)量，Northern blot是金標(biāo)準(zhǔn)，但是由于其靈敏度較低并且操作方法較繁瑣，一般不用于對臨床樣本的檢測[25]。實時熒光定量RT-PCR是檢測血清/血漿miRNA表達(dá)量的常用方法。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄引物的不同，實時熒光定量RT-PCR可以分為莖環(huán)狀引物法和多聚腺嘌呤加尾法。研究報道使用莖環(huán)狀引物法可以獲得更高的反轉(zhuǎn)錄效率和特異度。此外，根據(jù)化學(xué)發(fā)光原理的不同，還可分為熒光染料法和探針法。探針法在檢測的特異度和靈敏度方面優(yōu)于染料法。此外高通量序列分析法[28]和芯片法也用于對miRNA的檢測，但由于高通量序列分析法價格較昂貴，一般只用于探尋新的miRNA，而芯片法由于重復(fù)性較差，一般只用于miRNA的初篩。

今后隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，需要建立一套標(biāo)準(zhǔn)化的血液樣本收集、運(yùn)輸保存以及miRNA提取制備和實時熒光定量RT-PCR檢測技術(shù)體系以及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，確保miRNA檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化。

3 血清/血漿miRNA在肺癌診斷中的應(yīng)用

Keller等[29]報道肺癌患者的血清miRNA表達(dá)譜在確診為肺癌之前就已發(fā)生了改變。在此項研究中共收集到29份血清，其中6份來自6位健康志愿者，另外23份來自已確診為肺癌的8例患者。在這23份血清中，有15份是在臨床確診為肺癌之前收集到的。他們使用芯片法分析了這29份血清miRNA的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)血清miRNA表達(dá)譜可以在很長的時間里保持穩(wěn)定，但越接近確診為肺癌的時間點，miRNA的表達(dá)譜變化越明顯。

此外，Boeri等[6]將血漿miRNA與螺旋CT對肺癌的早期診斷進(jìn)行了對比。研究者使用螺旋CT對吸煙者進(jìn)行了肺癌篩查，并且收集了確診為肺癌時以及確診為肺癌之前的血漿。發(fā)現(xiàn)當(dāng)螺旋CT未報告異常時，使用血漿miRNA對肺癌進(jìn)行診斷，敏感度和特異度分別為80%和90%。而當(dāng)螺旋CT報告異常時，血漿miRNA對肺癌診斷的敏感度和特異度達(dá)到75%和100%，研究還發(fā)現(xiàn)某些血漿miRNA與肺癌患者的預(yù)后相關(guān)。

Chen等[4]報道使用10種血清miRNA聯(lián)合診斷NSCLC的敏感度和特異度分別達(dá)到93%和90%。為了獲得血清中差異表達(dá)的miRNA，研究者使用實時熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測了200例NSCLC患者和110位健康志愿者血清中的miRNA，篩選出10種miRNA，并在另外200例NSCLC患者和110位健康志愿者中對這些血清miRNA的表達(dá)差異情況進(jìn)行了驗證。發(fā)現(xiàn)使用這10種miRNA聯(lián)合診斷NSCLC的敏感度和特異度分別為93%和90%。此外他們還使用這10種血清miRNA在2,000名體檢者中進(jìn)行了NSCLC篩查，發(fā)現(xiàn)使用這10種血清miRNA對NSCLC進(jìn)行篩查，可以得到較好的檢出率。

此外，F(xiàn)oss等[23]報道血清miR-1254和miR-574-5p可以用于早期NSCLC的診斷，研究者使用芯片技術(shù)檢測了11例NSCLC患者和11位健康志愿者的血清miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)有4種miRNA的差異表達(dá)倍數(shù)達(dá)到了1.54倍。然后在另外的22例NSCLC患者和31位健康志愿者中對這種差異表達(dá)情況進(jìn)行了驗證。發(fā)現(xiàn)血清miR-1254和miR-574-5p聯(lián)合診斷早期NSCLC的價值最高，敏感度和特異度達(dá)到73%和71%。另外Shen等[20]也報道了血漿miRNA-21、miRNA-126、miRNA-210、miRNA-486-5p可以聯(lián)合診斷I期NSCLC。他們通過測定早期肺癌組織中的miRNA表達(dá)譜明確了12種miRNA與早期NSCLC有關(guān)，然后在28例I期NSCLC患者的肺癌組織和血漿中對這些miRNA進(jìn)行了篩選，并在另外58例NSCLC患者和29例健康志愿者的血漿中對篩選得到的miRNA進(jìn)行了驗證，發(fā)現(xiàn)這12種miRNA中有5種差異表達(dá)水平在血漿與肺癌組織中是一致的，并且通過Logistic回歸模型進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)有4種miRNA（miR-21、miR-126、miR-210、miR-486-5p）對診斷I期NSCLC的敏感度和特異度達(dá)到最高（分別為73.33%和96.55%），并且還發(fā)現(xiàn)這些miRNA診斷肺腺癌的敏感度（91.67%）明顯高于肺鱗癌（82.35%）。

Wei等[22]報道血漿miRNA-21可以作為NSCLC的診斷標(biāo)記物，并且還發(fā)現(xiàn)血漿miRNA-21的表達(dá)水平與肺癌的TNM分期相關(guān)，在T3-T4患者血漿中miRNA-21的表達(dá)水平高于T1-T2患者，III期-IV期患者的表達(dá)水平高于I期-II期患者的表達(dá)水平。使用血漿miRNA-21診斷NSCLC的敏感度和特異度分別為76.2%和70%。此外，還發(fā)現(xiàn)在使用以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療患者中，達(dá)到部分緩解的患者血漿中miRNA-21的表達(dá)水平明顯低于達(dá)到穩(wěn)定和進(jìn)展患者的表達(dá)水平。

另外Roth等[30]報道肺癌患者血清miRNA-10b、miRNA-34a、miRNA-141、miRNA-155的表達(dá)水平明顯高于健康者，并且還發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清miRNA-10b、miRNA-141、miRNA-155的表達(dá)水平高于肺部良性病變患者的表達(dá)水平，肺癌患者血清中miRNA-10b的高表達(dá)與肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

4 問題與展望

綜上所述， miRNA在血清/血漿中不僅可以穩(wěn)定存在，并且可以耐受各種極端環(huán)境的影響。在其穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，利用它在肺癌患者和健康者中表達(dá)譜的不同，可以將肺癌患者篩選出來，以更早地診斷肺癌，降低肺癌的死亡率。但是目前看來，利用血清/血漿miRNA診斷肺癌還存在一個重要問題：血清/血漿中缺少合適的內(nèi)參基因作為對照。對此已有學(xué)者提出疑問[31]，他們認(rèn)為由于缺乏合適的內(nèi)參基因作為對照，很可能造成實驗組與對照組實驗數(shù)據(jù)之間不具有可比性，因此利用血清/血漿中的miRNA診斷肺癌并不合適。此外，由于目前文獻(xiàn)報道的用于抽提miRNA的血清/血漿量的不同以及抽提方法和定量方法的不同，造成了相關(guān)文獻(xiàn)報道的用于診斷肺癌的miRNA不同。因此在后續(xù)的研究中希望可以找出合適的內(nèi)參基因作為對照，并建立起使用血清/血漿miRNA診斷肺癌的標(biāo)準(zhǔn)化程序，促進(jìn)血清/血漿miRNA在肺癌診斷中的應(yīng)用。