低氧對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖及分化的影響

杜 娟， 陳 立， 陳 麗綜述， 呂曉紅審校

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)是近年來治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病頗具前景的基因工程細(xì)胞，尤其是在神經(jīng)功能修復(fù)方面，具有重要的科學(xué)意義及社會(huì)應(yīng)用價(jià)值。對(duì)于神經(jīng)功能損傷的治療，目前僅限于內(nèi)科藥物治療及外科手術(shù)干預(yù)，但對(duì)于已經(jīng)喪失的神經(jīng)功能的恢復(fù)和重建，這些治療措施都無根本性療效。而神經(jīng)干細(xì)胞的研究和發(fā)展為解決這一問題提供了重要的途徑和手段，成為研究的熱點(diǎn)。但神經(jīng)干細(xì)胞移植目前仍處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，究竟是什么制約這一研究的進(jìn)展呢?眾所周知，神經(jīng)干細(xì)胞首先要在移植體內(nèi)存活，才能發(fā)揮作用。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在被移植入損傷區(qū)后，神經(jīng)干細(xì)胞的存活、增殖、分化以及遷徙過程均受到局部復(fù)雜微環(huán)境等因素的影響，特別是腦血管疾病中缺血缺氧的局部微環(huán)境，這是制約干細(xì)胞移植的瓶頸之一。隨著對(duì)這些問題認(rèn)識(shí)的不斷深入和研究的不斷進(jìn)展，到目前為止的證據(jù)表明干細(xì)胞療法的繼續(xù)發(fā)展，最終可能成為缺血性腦損傷可行的治療選擇。

1 氧濃度是神經(jīng)干細(xì)胞微環(huán)境中的重要組分

自我更新和多能性是干細(xì)胞的特性，而這種特性與干細(xì)胞所處環(huán)境中各種因素的平衡密切相關(guān)，該環(huán)境稱為微環(huán)境，早在1978年Schofield就提出了這一概念，即細(xì)胞、細(xì)胞間質(zhì)及影響細(xì)胞生長(zhǎng)的各種因素組成的復(fù)雜而統(tǒng)一的環(huán)境，微環(huán)境中的任何因素發(fā)生變化，都會(huì)轉(zhuǎn)化成一定的信號(hào)進(jìn)而影響細(xì)胞。其中包括傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)中的培養(yǎng)基成分、營(yíng)養(yǎng)因子、pH、氧濃度等，特別是氧氣濃度成為一直以來研究的熱點(diǎn)，被認(rèn)為是微環(huán)境中非常重要的因素。以往認(rèn)為細(xì)胞生存所需氧濃度與大氣中氧濃度(21%，160mmHg)相同，但在生物體內(nèi)并非如此，氧氣從被吸入肺部然后隨血液運(yùn)送至全身，到達(dá)器官和組織時(shí)其濃度和壓力已非常低(2% ～9%，14～65 mmHg)。近年來研究亦顯示，體內(nèi)多種組織特別是含有干細(xì)胞的組織中氧濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于大氣氧濃度，而微環(huán)境中的這種低氧狀態(tài)不管對(duì)胚胎干細(xì)胞還是成體干細(xì)胞的生物學(xué)行為影響都非常巨大［1］。如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞所處的微環(huán)境便是一種低氧環(huán)境，氧濃度約為1% ～7%。體外實(shí)驗(yàn)表明，低氧可以使干細(xì)胞的細(xì)胞周期減慢，分化減少。1%氧濃度下較21%氧濃度下，間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)生了各方面的變化。細(xì)胞在形態(tài)上表現(xiàn)出體積增大;細(xì)胞的增殖明顯減少并且大部分停止在G1期［2］。另有研究表明，低氧在骨髓造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成熟過程中起重要作用。且低氧持續(xù)時(shí)間是細(xì)胞分化潛能的一個(gè)鑒定指標(biāo)。在更接近于生理?xiàng)l件的缺氧環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)的研究顯示，與常氧濃度下培養(yǎng)相比，在5%氧濃度下，細(xì)胞的分化減少，其干細(xì)胞特性保持的更強(qiáng)，這可能暗示體內(nèi)的低氧環(huán)境可以使更多的干細(xì)胞處于靜息狀態(tài)［3］。對(duì)于神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，間歇性低氧可以增強(qiáng)其類似干細(xì)胞的特性，并抑制其分化傾向，這似乎從另一方面證明了氧濃度對(duì)干細(xì)胞的作用［4］。

神經(jīng)干細(xì)胞是干細(xì)胞的一種，具有自我更新、增殖及分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的能力。在成體，神經(jīng)干細(xì)胞主要存在于側(cè)腦室室管膜下層(subventricular zone，SVZ)和海馬齒狀回顆粒下層(subgranular zone，SGZ)，這是目前公認(rèn)的兩個(gè)神經(jīng)發(fā)生區(qū)域。有研究顯示小鼠的腦組織中氧分壓亦遠(yuǎn)低于大氣，中腦處約為0.55%，大腦皮質(zhì)處約為8%，神經(jīng)干細(xì)胞亦處于一種相對(duì)低氧的特殊微環(huán)境中，推測(cè)該微環(huán)境中氧濃度約為2.5% ～3%［5］。生理狀態(tài)下的這種低氧會(huì)減慢細(xì)胞周期和抑制分化，可能對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞保持一種未分化的類似“休眠”的穩(wěn)定狀態(tài)有一定作用［6］，體外研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。在缺血缺氧性腦卒中事件中，神經(jīng)干細(xì)胞所處的微環(huán)境更為特殊，其中的氧濃度較生理狀態(tài)更低，但研究顯示，在大腦中動(dòng)脈閉塞引起局灶性腦缺血缺氧部位移植神經(jīng)干/祖細(xì)胞，不但神經(jīng)干細(xì)胞自身的存活能力及增殖分化能力提高，而且可以減少局部神經(jīng)元的凋亡，這個(gè)過程主要由缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1alpha，HIF-1α)-血 管 內(nèi) 皮 生 長(zhǎng) 因 子 (Vascular endothelial growth factors，VEGF)信號(hào)途徑(HIF-1α-VEGF)介導(dǎo)［7］。因此，氧濃度是神經(jīng)干細(xì)胞生存微環(huán)境中重要的組成部分，低氧能夠增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞自身的增殖和成熟過程，同時(shí)神經(jīng)干細(xì)胞通過一系列的變化也影響其所處的微環(huán)境。

2 低氧影響神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化

在體內(nèi)環(huán)境中，從胚胎形成到圍產(chǎn)期以及成人的神經(jīng)發(fā)育過程中，神經(jīng)干細(xì)胞所處的氧濃度是不斷變化的。如前所述，神經(jīng)干細(xì)胞在成體內(nèi)多數(shù)情況下處于一種類似“休眠”的狀態(tài)，但受到各種生理或病理性刺激時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞就會(huì)進(jìn)入增殖及分化階段。而缺血性腦卒中是重要的刺激因素之一，Ohira等人發(fā)現(xiàn)，缺血性損傷會(huì)激活新大腦皮質(zhì)的神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞，并促進(jìn)其增殖和分化［8］。在發(fā)生缺血性腦卒中的腦組織局部會(huì)形成特殊的血管微環(huán)境，而血管周圍相對(duì)的缺血缺氧狀態(tài)是影響神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)行為的主要因素。在缺血缺氧性腦卒中事件中，大腦會(huì)出現(xiàn)自身的修復(fù)，并且存在新的神經(jīng)元的發(fā)生。最新研究表明，神經(jīng)干細(xì)胞會(huì)向缺血缺氧的腦組織區(qū)域募集，趨化因子CCL2及其受體CCR2在此過程中起關(guān)鍵作用［9］。被募集到缺血缺氧的腦組織區(qū)域的神經(jīng)干細(xì)胞的存活及增殖能力都大大提高，并且通過間質(zhì)衍生因子-1和血管生成素-1與血管的重建和再生產(chǎn)生密切關(guān)聯(lián)。

在體外培養(yǎng)條件下，氧濃度對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響顯得更為突出。早在2000年，Studer等人就提出了氧濃度對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的生物學(xué)作用，他們通過對(duì)比常氧(152mmHg)和低氧(22.8±15.2mmHg)環(huán)境下鼠胚胎神經(jīng)祖細(xì)胞的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，低氧濃度促進(jìn)細(xì)胞的增殖，同時(shí)減少了細(xì)胞的凋亡;另外，神經(jīng)祖細(xì)胞向神經(jīng)元的分化亦受影響，在低氧濃度下，多巴胺能神經(jīng)元比率上升到56%，而常氧濃度下其比率僅為18%［10］。而最近研究顯示，在低氧濃度下(2%O2)，胚胎干細(xì)胞在早期會(huì)出現(xiàn)一定程度的分化，且主要為神經(jīng)祖細(xì)胞的分化。這個(gè)過程主要靠成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF4)/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)的自分泌和糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)信號(hào)通路調(diào)節(jié)［11］。因此，氧氣在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生及形成過程中均扮演著重要的角色。Morrison等也提出在低氧濃度下(38mmHg)神經(jīng)嵴干細(xì)胞的存活率、增殖率及兒茶酚胺類神經(jīng)元的分化率均提高［12］。另有研究表明，源于孕15～16d的美國(guó)癌癥研究所小鼠(institute of cancer researcch，ICR)胚胎的神經(jīng)干細(xì)胞在15.2mmHg的氧濃度下表現(xiàn)出最強(qiáng)的增殖及分化能力［13］。低氧和抗氧化劑也可增加來源于腸神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。而來源于人類胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞，在3%氧濃度下與常氧濃度下相比其存活率亦增加，且在特定趨化因子作用下，可以向脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、多巴胺神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元前體細(xì)胞特定分化［14］。因此，在體外培養(yǎng)條件下，氧濃度會(huì)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，對(duì)其分化方向也有一定誘導(dǎo)作用，且主要向多巴胺能神經(jīng)元分化。在體內(nèi)及體外條件下，氧濃度對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的調(diào)節(jié)主要涉及以下幾個(gè)機(jī)制。

2.1 細(xì)胞因子及相關(guān)信號(hào)途徑 HIF-1是氧濃度對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖及分化調(diào)節(jié)過程中重要的細(xì)胞因子，有α和β兩個(gè)亞基。HIF-1α是調(diào)節(jié)細(xì)胞缺氧適應(yīng)過程中重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，在多數(shù)細(xì)胞和組織中，其含量很低，在胞質(zhì)內(nèi)處于失活狀態(tài);但是在缺氧條件下其含量則升高，可被激活并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并與HIF-1β形成HIF-1分子，識(shí)別并結(jié)合包含有低氧反應(yīng)元件的DNA序列。

在缺血性神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，HIF-1α在神經(jīng)祖細(xì)胞的存活及替代缺血壞死神經(jīng)細(xì)胞的過程中起重要作用。HIF-1α通過對(duì)細(xì)胞新陳代謝、血管再生的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)來完成機(jī)體對(duì)缺氧的適應(yīng)［15］。在胚胎干細(xì)胞中HIF-1α主要是通過提高β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的活性及下游效應(yīng)器淋巴增強(qiáng)因子-1(lymphoid enhancer factor-1，LEF-1)和 T細(xì)胞因子 1(Tcellfactor4，TCF-4)的表達(dá)來調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路。這種調(diào)節(jié)在神經(jīng)干細(xì)胞中也是存在的，但是在已分化的細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)［16］。另有研究表明，在成年腦組織的神經(jīng)發(fā)生區(qū)域、神經(jīng)干/祖細(xì)胞、出生后的小鼠腦組織中，HIF-1α持續(xù)表達(dá)。在正常情況下的神經(jīng)干/祖細(xì)胞中，HIF-1α不會(huì)發(fā)生典型的羥基化、泛素化及退化。HIF-1α主要存在于細(xì)胞質(zhì)的膜結(jié)構(gòu)中，免疫電子顯微鏡證實(shí)了含有HIF-1α的囊泡，這種結(jié)構(gòu)可能防止HIF-1α的退化。而經(jīng)過HIF-1α相關(guān)基因敲除的神經(jīng)干/祖細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受性降低，且Notch-1和β-catenin的表達(dá)水平發(fā)生顯著的變化，而這些分子與缺氧耐受存在密切關(guān)系［17］。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞增殖的關(guān)鍵通路，在低氧促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖過程中也起著重要作用。研究顯示，在利用缺氧(5%O2)環(huán)境促進(jìn)海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖過程中，Wnt/β-catenin信號(hào)途徑起關(guān)鍵作用，β-catenin是其中主要的蛋白［18］。在體內(nèi)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性與SGZ密切相關(guān)，而該處亦是神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生的主要區(qū)域。HIF-1α缺失會(huì)使Wnt/β-catenin信號(hào)通路受抑制，從而使干細(xì)胞的增殖、分化及成熟受累［16］。

另外，缺氧促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖和分化，此過程中促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)促進(jìn)了細(xì)胞的分化，減少了細(xì)胞的凋亡。缺氧特異性的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子過度表達(dá)有利于移植神經(jīng)干細(xì)胞存活和神經(jīng)功能的改善［19］。而EPO聯(lián)合粒細(xì)胞集落刺激因子能夠促進(jìn)缺血缺氧動(dòng)物模型神經(jīng)功能的恢復(fù)，其機(jī)制包括增強(qiáng)抗細(xì)胞凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)，增強(qiáng)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的合成和促進(jìn)新生血管再生［20］。也有研究顯示，缺氧誘導(dǎo)的VEGF基因表達(dá)系統(tǒng)能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的存活力。表達(dá)缺氧特異性VEGF的神經(jīng)干細(xì)胞應(yīng)用于脊髓損傷模型中，可以提高移植細(xì)胞的存活率及促進(jìn)血管再生，同時(shí)抑制不需要的細(xì)胞及血管的增生［21］。

2.2 基因水平改變 基因水平改變其實(shí)是細(xì)胞因子及相關(guān)信號(hào)通路調(diào)節(jié)過程中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它們相互促進(jìn)，不可分割。當(dāng)然這個(gè)過程中也會(huì)存在一些特殊的變化。研究表明，非編碼微小 RNA(non coding RNA，ncRNA)在神經(jīng)發(fā)育、細(xì)胞存活等過程中扮演關(guān)鍵角色。在缺氧條件下，ncRNAs參與細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)過程，有15種微小RNA(microRNA，miR)的水平上調(diào)，11種下調(diào)，其中miR-210上調(diào)明顯。進(jìn)一步研究表明 HIF-1α對(duì)miR-210有直接影響作用［22］。在基因修復(fù)方面，核酸內(nèi)切酶Neil3可以通過準(zhǔn)確的DNA分子修復(fù)使神經(jīng)干細(xì)胞避免遭受缺血缺氧損傷，而Neil 3缺陷的神經(jīng)干細(xì)胞不能完成向神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖和單鏈DNA氧化應(yīng)激的修復(fù)［23］。另外，反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)分析顯示表達(dá)細(xì)胞間黏附分子的mRNA水平亦發(fā)生改變，其中最明顯的是表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的mRNA。在1%氧濃度下，抑制MMP-9的活性，細(xì)胞的增殖和遷移會(huì)降低，而且，通過Wnt通路拮抗劑DKK-1(dikkopf-1)抑制HIF-1α介導(dǎo)的經(jīng)典Wnt信號(hào)通路時(shí)，細(xì)胞的增殖降低，MMP-9表達(dá)也減少。因此，MMP-9亦是低氧濃度促進(jìn)干細(xì)胞增殖機(jī)制中的關(guān)鍵分子之一［24］。

2.3 代謝水平的變化 能量代謝中的相關(guān)分子和信號(hào)途徑影響神經(jīng)干細(xì)胞的功能，包括胰島素生長(zhǎng)因子(insulin growth factor 1，IGF-1)-轉(zhuǎn)錄因子FoxO和IGF-1-雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)途徑、腺苷酸活化蛋白激酶、沉默信息調(diào)節(jié)因子(silentmating type information regulation 2 homolog1，SIRT1)和HIF。在低氧(3%O2)條件下，培養(yǎng)基中葡萄糖含量降低，而丙酮酸、乳酸含量升高，說明在低氧環(huán)境下，神經(jīng)祖細(xì)胞主要靠糖酵解獲取能量。而這一過程中，通過對(duì)基因分析檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，1.24%的基因表達(dá)發(fā)生變化，其中絕大多數(shù)涉及糖酵解途徑［25］。另外，在體外缺氧誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖過程中，代謝型谷氨酸受體亞型5(metabotropic glutamate receptor 5 subtype，mGluR5) 的表達(dá)有增高。在此過程中胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)和氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase，JNK)信號(hào)通路及細(xì)胞周期蛋白 D1的表達(dá)增加。這些結(jié)果還表明mGluR5參與神經(jīng)干細(xì)胞增殖，并且為中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血/缺氧損傷后的神經(jīng)功能修復(fù)提供了一個(gè)目標(biāo)分子［26］。

3 缺氧預(yù)處理提高神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)抗缺血缺氧的能力

低氧預(yù)適應(yīng)是機(jī)體的一種重要的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，而缺氧預(yù)處理對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞是否亦存在同樣的保護(hù)作用呢?如前所述，人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)移植是治療缺血性卒中頗具潛力的治療方法，但是宿主的內(nèi)環(huán)境阻礙了此技術(shù)的發(fā)展。最近研究表明經(jīng)缺氧預(yù)處理的ESCs適應(yīng)能力增強(qiáng)。將來源于hESCs的神經(jīng)球在0.1%氧濃度下培養(yǎng)12h，然后在21%氧繼續(xù)培養(yǎng)分化，免疫組織化學(xué)及電生理檢查證明預(yù)處理能增強(qiáng)細(xì)胞分化。且這種神經(jīng)保護(hù)作用至少持續(xù)5d，具有神經(jīng)保護(hù)作用的蛋白質(zhì)的表達(dá)也相應(yīng)上調(diào)［27］。缺氧預(yù)處理增強(qiáng)干細(xì)胞對(duì)抗缺血缺氧能力的同時(shí)，對(duì)于移植細(xì)胞和宿主細(xì)胞的存活率都能提高。缺氧預(yù)處理的脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞與未經(jīng)缺氧預(yù)處理的相比，形態(tài)學(xué)沒有發(fā)生明顯的變化，且這種經(jīng)缺氧預(yù)處理干細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞共同移植時(shí)，能夠提高神經(jīng)干細(xì)胞的存活率，減少凋亡因子Bax的表達(dá)［28］。缺氧預(yù)處理增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)抗缺血缺氧能力的機(jī)制尚不十分明確，研究表明，缺氧預(yù)處理后免疫印跡顯示HIF-1α和HIF-2α的表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)引起了一系列相互促進(jìn)的反應(yīng)，包括EPO、VEGF和 Bcl 2家族成員［27］。另有研究表明，在鼠神經(jīng)干細(xì)胞的缺氧預(yù)適應(yīng)中涉及到Xc系統(tǒng)(胱氨酸和谷氨酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的跨膜蛋白)，并證明該蛋白與缺氧預(yù)適應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)［29］?？p隙連接在缺氧預(yù)處理過程中亦發(fā)生變化，縫隙連接是宿主細(xì)胞和被移植的神經(jīng)干細(xì)胞之間重要的結(jié)構(gòu)，它對(duì)細(xì)胞的功能及細(xì)胞之間的相互作用非常重要。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血缺氧性疾病中，縫隙連接會(huì)增多。此研究顯示，缺氧預(yù)處理，會(huì)使連接蛋白43(connexin 43，Cx43)的表達(dá)增高，宿主和移植物之間的信息流通提高。本研究顯示，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行3h的缺氧預(yù)處理，會(huì)使Cx43的表達(dá)提高31%［30］。

4 展望

氧濃度對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的研究使得干細(xì)胞學(xué)科更加完善和深入，并且必將推動(dòng)神經(jīng)干細(xì)胞移植治療的進(jìn)一步發(fā)展，尤其是在缺血缺氧性腦卒中中的應(yīng)用與研究。雖然低氧條件下的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)已取得一定進(jìn)展，但仍存在很多的未知，這需要我們進(jìn)一步的研究。

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