骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在關(guān)節(jié)軟骨損傷中的應(yīng)用

劉志強(qiáng)，程紅斌，劉建國(guó)＊，景元海

（1.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院 骨關(guān)節(jié)二科，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.武警總醫(yī)院 神經(jīng)干細(xì)胞移植科，北京 1000397；3.大慶總醫(yī)院集團(tuán)龍南醫(yī)院 骨科，黑龍江 大慶 163000）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在關(guān)節(jié)軟骨損傷中的應(yīng)用

劉志強(qiáng)1，程紅斌2，劉建國(guó)1＊，景元海3

（1.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院 骨關(guān)節(jié)二科，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.武警總醫(yī)院 神經(jīng)干細(xì)胞移植科，北京 1000397；3.大慶總醫(yī)院集團(tuán)龍南醫(yī)院 骨科，黑龍江 大慶 163000）

＊通訊作者

隨著細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和材料學(xué)等基礎(chǔ)科學(xué)的快速發(fā)展，組織工程研究和應(yīng)用得以飛速發(fā)展，為軟骨缺損修復(fù)這個(gè)醫(yī)學(xué)難題開辟了全新領(lǐng)域。骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）在體外大量擴(kuò)增對(duì)其最終在體內(nèi)形成軟骨組織無明顯影響并可分化成軟骨和骨組織，正是由于這些特性，使之成為組織工程軟骨構(gòu)建中熱門的種子細(xì)胞。本文對(duì)BMSCs在軟骨損傷中的應(yīng)用進(jìn)展加以綜述。

1 軟骨損傷機(jī)制

關(guān)節(jié)軟骨的損傷根據(jù)損傷類型和修復(fù)反應(yīng)的不同，可以被區(qū)分為3個(gè)等級(jí)：①軟骨表面完好的軟骨內(nèi)損傷，伴或不伴軟骨下骨損傷。②局限于關(guān)節(jié)軟骨的非全層軟骨缺損，未累及軟骨下骨。③關(guān)節(jié)軟骨并軟骨下骨的全層缺損。關(guān)節(jié)表面完好的軟骨內(nèi)損傷病理改變?yōu)檐浌腔|(zhì)斷裂，存活軟骨細(xì)胞可增強(qiáng)合成功能來修復(fù)組織。局限于關(guān)節(jié)軟骨的非全層缺損無法自愈，通常認(rèn)為損傷未及軟骨下骨，無法引出骨髓中的干細(xì)胞。累及軟骨和軟骨下骨的全層缺損，由于損傷貫通軟骨硬化區(qū)和軟骨下骨，骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞等可遷至軟骨損傷處，生成修復(fù)性的纖維軟骨組織。這種修復(fù)組織在生物力學(xué)性能、耐久性等方面遠(yuǎn)不及健康軟骨，但可覆蓋、保護(hù)缺損區(qū)軟骨下骨，減少軟骨磨損和游離屑的形成。

2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在關(guān)節(jié)軟骨損傷中的應(yīng)用

其基本方法是將自體或異體的組織細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增后，接種到一種生物相容性良好可吸收的生物材料上，形成細(xì)胞生物材料復(fù)合物，再回植到體內(nèi)組織缺損部位，隨著生物材料逐漸被機(jī)體吸收，細(xì)胞分化生長(zhǎng)成新的有功能的組織，從而達(dá)到修復(fù)缺損的目的。主要涉及到種子細(xì)胞、支架材料和生長(zhǎng)因子3個(gè)基本要素。

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是目前研究最多、應(yīng)用最廣的種子細(xì)胞之一。它具有典型的干細(xì)胞特點(diǎn)，終身存在于骨髓和其他組織器官中，負(fù)責(zé)組織的修復(fù)和更新，而且具有多向分化潛能，在不同的誘導(dǎo)條件下可以分化成許多不同的組織［1］。

2.1.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特點(diǎn) 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）具有多向分化潛能，在不同的誘導(dǎo)條件下可以分化成許多不同的組織，如骨組織、軟骨組織、脂肪組織、內(nèi)皮組織、肌肉組織等。由于BMSCs的自我復(fù)制和多向分化的能力，近年來在組織工程骨構(gòu)建過程中應(yīng)用廣泛。BMSCs取材方便、創(chuàng)傷小且易于從骨髓中分離及體外擴(kuò)增純化，不像滑膜、脂肪等來源的BMSCs原代培養(yǎng)需要酶消化預(yù)處理。骨髓BMSCs雖僅占有核細(xì)胞數(shù)的0.001%－0.01%，但始終穩(wěn)定保持分化成軟骨細(xì)胞的能力，是終身可用的軟骨前體細(xì)胞。骨髓BMSCs具有CD105（即TGF-β受體），細(xì)胞成軟骨潛能似與CD105表達(dá)有關(guān)。與滑膜、脂肪等來源的BMSCs相比，BMSCs標(biāo)志基因在平面培養(yǎng)時(shí)差異不明顯，而在三維高密度培養(yǎng)時(shí)基因差別顯著，有且只有BMSCs的軟骨分化才能獲得明顯的改善［2］。自體骨髓BMSCs不存在免疫排斥，且BMSCs體外基因轉(zhuǎn)染高并能穩(wěn)定高效表達(dá)外源基因等優(yōu)點(diǎn)［3］。

2.1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞獲得 隨著對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞深入廣泛的研究，目前已建立了多種分離純化的方法，為其在組織工程和基因工程上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。常用的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離與純化方法有：①密度梯度離心法。②貼壁細(xì)胞分離法。③ 流式細(xì)胞儀分選法。④磁珠分選法。

至今尚無明確的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定方法，但利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的一些生物學(xué)特征、表面標(biāo)志物及特異性基因的表達(dá)，再借助一些實(shí)驗(yàn)技術(shù)，可基本達(dá)到區(qū)分它們的目的。關(guān)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的報(bào)道很多，但研究結(jié)論極不一致，尚缺乏單一明確的表面標(biāo)志物［4，5］。

2.2 相關(guān)的生物活性細(xì)胞因子的選擇

與BMSCs相關(guān)的細(xì)胞因子主要有轉(zhuǎn)化因子-β（TGF-β）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）、成纖維生長(zhǎng)因子（FGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）等。

2.2.1 轉(zhuǎn)化因子-β（TGF-β） 轉(zhuǎn)化因子-β（TGF-β）是當(dāng)前最強(qiáng)的細(xì)胞促生長(zhǎng)因子。研究表明，TGF-β可以明顯促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，刺激Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達(dá)，增加成骨細(xì)胞數(shù)量。大多數(shù)離體研究表明TGF-β可增加成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物，如堿性磷酸酶、I型膠原、骨粘連蛋白的表達(dá)，還可增加堿性磷酸酶水平。另外，TGF-β1能減少膠原酶轉(zhuǎn)錄并加速膠原酶mRNA降解，這有利于維持骨中的膠原基質(zhì)［6］。一些實(shí)驗(yàn)也說明了不同濃度的TGF-β1對(duì)BMSCs具有不同的誘導(dǎo)效率，10μg／L TGF-β1可能BMSCs向軟骨細(xì)胞分化的最佳誘導(dǎo)濃度［7，8］。

2.2.2 骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP） 骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone m0rphogenetic protein，BMP）是一組疏水性的酸性糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子超家族。是目前唯一被確認(rèn)具有異位成骨能力的生長(zhǎng)因子。其中研究最多也是成骨活性最強(qiáng)的是BMP-2和BMP-7。Lin等［9］研究發(fā)現(xiàn)：骨形態(tài)發(fā)生蛋白可以促進(jìn)MSCs向成骨方向轉(zhuǎn)化。

2.2.3 胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1） 胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF-1）是一種強(qiáng)有力的合成代謝刺激因子，是目前已知的調(diào)節(jié)軟骨代謝和維持軟骨內(nèi)環(huán)境諸多因素中最關(guān)鍵的生長(zhǎng)因子之一。研究表明胰島素樣生長(zhǎng)因子1可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，還可抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子p1引起的細(xì)胞外焦磷酸鹽的積聚，防止焦磷酸鈣結(jié)晶的形成和進(jìn)一步成骨，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1重要的輔助因子［10］。

2.2.4 堿性成纖維生長(zhǎng)因子（bFGF） 堿性成纖維生長(zhǎng)因子（bFGF）是一種肝素粘合多肽，在人體組織中廣泛存在，具有多種生物活性，包括促進(jìn)毛細(xì)血管增殖、細(xì)胞有絲分裂，從而影響細(xì)胞的增殖和分化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)bFGF可明顯促進(jìn)BMSCs的增殖并能增加傳代的次數(shù)［11］。研究顯示bFGF和地塞米松對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與分化的影響，結(jié)果顯示1.0－10.0ng／ml的bFGF可促進(jìn)BMSCs的增殖，濃度再高則促增殖作用無明顯提高甚至下降。這說明bFGF對(duì)BMSCs的增殖有劑量依賴性［12］。

2.2.5 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF） 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）又稱血管通透因子（VPF）或（VAS）。近年來研究表明，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子對(duì)中胚層細(xì)胞分化有作用，可以使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化。

2.2.6 多種生長(zhǎng)因子聯(lián)合應(yīng)用 軟骨生長(zhǎng)的微環(huán)境有很多生長(zhǎng)因子，不同的生長(zhǎng)因子相互影響，彼此形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，軟骨生長(zhǎng)、代謝需要多種生長(zhǎng)因子共同參與。目前研究者關(guān)注多個(gè)因子的聯(lián)合應(yīng)用以及其他因素與因子間的相互作用。

Ozono［13］分別將bFGF與IGF、17β-雌二醇（E2）聯(lián)合應(yīng)用，結(jié)果表明聯(lián)合使用能更有效地促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨性分化。TGF-β1、BMP-2聯(lián)合作用更能促進(jìn) BMSCs向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，分泌軟骨特異性基質(zhì)［14］。多個(gè)因子的聯(lián)合應(yīng)用可以更好地修復(fù)軟骨缺損使其成為當(dāng)今組織工程的研究熱點(diǎn)，但并非所有的生長(zhǎng)因子之間的組合都是有利的，研究發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長(zhǎng)因子1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β聯(lián)合應(yīng)用修復(fù)軟骨并沒有得到明顯的改善，機(jī)械強(qiáng)度也沒達(dá)到理想強(qiáng)度［21］。

2.3 支架材料的選擇

組織工程中支架材料即人工的細(xì)胞外基質(zhì)。理想的軟骨組織工程支架材料應(yīng)具有：① 良好的生物相容性，利于細(xì)胞貼附，無毒性，不引起炎性反應(yīng)，不能引起宿主的排異反應(yīng)。②可塑性和一定的力學(xué)強(qiáng)度：可預(yù)先制作成一定形狀并為新生組織提供一定強(qiáng)度的支撐，且可保持至新生組織具有自身生物力學(xué)特性。③良好的生物降解性：材料降解速率與種植入的細(xì)胞組織形成的速率匹配，組織再生后則被完全降解吸收，同時(shí)降解產(chǎn)物無毒，能及時(shí)排出體外。④具有三維立體多孔結(jié)構(gòu)且至少達(dá)90%大小合適的孔隙，為大量種子細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)、代謝等提供良好條件，同時(shí)還能讓血管長(zhǎng)入支架。⑤良好的表面活性：激活細(xì)胞特異基因表達(dá)，維持細(xì)胞表型正常表達(dá)。⑥價(jià)格低廉，來源廣泛，可以大量重復(fù)生產(chǎn)。目前與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合應(yīng)用得較多的支架材料有以下幾種。

2.3.1 多孔生物降解聚合物 多孔生物降解聚合物中較常用的是聚乳酸（PLA）、聚羥基乙酸（PGA）及其共聚物（PLGA）。其中，PLGA是目前應(yīng)用比較廣泛，具有低降解度和高藥物滲透性的特點(diǎn)，具有良好可吸收性的生物降解可植入高分子材料。有學(xué)者通過將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種到PLGA納米纖維支架上，發(fā)現(xiàn)兩周后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能持續(xù)分化成成骨細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞［15］。

2.3.2 膠原 膠原是多種組織的主要成分和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在體內(nèi)以膠原纖維的形式存在，其纖維狀結(jié)構(gòu)利于組織培養(yǎng)中細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)繁殖。膠原不論是作為皮膚、骨胳替代品，生物工程膜，或組織培養(yǎng)系統(tǒng)支架，應(yīng)用都越來越廣泛。研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞，復(fù)合膠原凝膠移植，修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，確定良好效果。

2.3.3 殼聚糖 殼聚糖（chitosan，CS）通過甲殼素殼聚糖β－（1-4）聚-2-乙酰胺基-D-葡糖脫乙?；纬?，具有良好的生物相容性、可降解性，近年來成為生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域研究較多的材料之一。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞放在殼聚糖－珊瑚復(fù)合支架上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的貼附、增殖和成骨分化能力都優(yōu)于單純的殼聚糖支架［16］。

2.3.4 種子細(xì)胞-支架復(fù)合物 BMSCs復(fù)合三維PLGA支架應(yīng)用顯示：用兔自體骨髓血分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種植于三維PLGA支架，共同體外培養(yǎng)2周后移植修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損。術(shù)后4周，骨軟骨缺損被新形成的光滑白色組織所填充，但是邊緣與周圍正常軟骨組織有顏色不同的界限。組織學(xué)觀察有培養(yǎng)的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)。術(shù)后12周，缺損處填充以光滑、白色并有光澤的組織，類似完整的關(guān)節(jié)軟骨邊緣與正常軟骨組織模糊。組織學(xué)觀察有再生的類透明軟骨和大量細(xì)胞外基質(zhì)［17］。

2.3.5 種子細(xì)胞-支架-細(xì)胞因子復(fù)合物 將攜帶 TGF-β1凝膠微球（MS-TGFβ1）的多孔水凝膠-軟骨素-透明質(zhì)酸支架復(fù)合自體BMSCs培養(yǎng)后修復(fù)兔全層關(guān)節(jié)軟骨缺損，通過觀察，再生軟骨細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、整合性、與軟骨下骨的連續(xù)性及再生軟骨層的厚度方面均獲得了更好的修復(fù)［18］。

2.4 物理環(huán)境影響

同時(shí)力學(xué)環(huán)境也起到一定促進(jìn)分化作用。適當(dāng)?shù)膭?dòng)態(tài)壓縮和由纖維蛋白與彈性PLCL混合成的支架三維環(huán)境下，可以促進(jìn)BMSCs分化成軟骨細(xì)胞，保持其表型和促進(jìn)聚糖的產(chǎn)生，從而改善軟骨組織在體內(nèi)和體外的質(zhì)量［19］。振動(dòng)拉伸載荷的差異能夠影響三維纖維蛋白凝膠對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞亞群的構(gòu)造，暴露于特定拉伸載荷的細(xì)胞被分成了向深層區(qū)域發(fā)展和淺層的軟骨細(xì)胞，這可能表明了細(xì)胞對(duì)新的力學(xué)環(huán)境的適應(yīng)。單一周期（40min，2 000με）的機(jī)械張力提高其堿性磷酸酶的活性，顯著上調(diào)TGF-β和IGF-Ⅱ的表達(dá)，還可促進(jìn)BMSCs增殖［20］。目前，已證實(shí)了應(yīng)力刺激確實(shí)有利于BMSCs向軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，但在體外誘導(dǎo)中最佳的施力大小，施力方式及作用時(shí)間等尚不明確，需要進(jìn)一步研究探索［21］。

2.5 基因轉(zhuǎn)染技術(shù)

用基因芯片技術(shù)建立妊娠胎鼠肢芽軟骨發(fā)育過程的基因表達(dá)譜，分析MAPK信號(hào)通路中bFGF在軟骨發(fā)育過程中的基因表達(dá)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)FGF能夠啟動(dòng)MAPK信號(hào)通路從而促進(jìn)軟骨形成。bFGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs后促進(jìn)BMSCs的增殖，細(xì)胞有向軟骨細(xì)胞分化趨勢(shì)。

龍華等［22］以腺病毒AdEasy為基因轉(zhuǎn)移載體，制備攜帶轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和骨形態(tài)發(fā)生蛋白7基因的高滴度腺病毒感染兔間充質(zhì)干細(xì)胞與骨基質(zhì)明膠（BMG）支架相復(fù)合體外構(gòu)建組織工程化軟骨，移植修復(fù)同種異體兔關(guān)節(jié)軟骨缺損，經(jīng)組織染色和電鏡觀察可見前體軟骨細(xì)胞大量增殖，在體移植修復(fù)實(shí)驗(yàn)組新生組織為類透明軟骨，修復(fù)效果明顯優(yōu)于各對(duì)照組。得出間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)攜帶轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和骨形態(tài)發(fā)生蛋白7基因的腺病毒感染后，體外能向軟骨細(xì)胞作定向分化，可用于制備組織工程化軟骨，使提高關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)質(zhì)量成為可能。

基因治療現(xiàn)在還處在實(shí)驗(yàn)探索階段，還存在許多問題如安全性能問題，基因調(diào)控性差，轉(zhuǎn)染率較低等問題，但隨著對(duì)軟骨細(xì)胞損傷機(jī)制研究深入，基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的改進(jìn)，基因治療將會(huì)在軟骨細(xì)胞修復(fù)中廣泛應(yīng)用。

3 小結(jié)及展望

以干細(xì)胞工程為代表的現(xiàn)代組織工程學(xué)是近年來迅猛發(fā)展的新領(lǐng)域，干細(xì)胞工程作為組織工程的前沿研究，對(duì)未來的組織器官修復(fù)與替代具有極其重要的作用和深遠(yuǎn)的影響。盡管還有許多問題需要進(jìn)一步研究，但骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞使關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)已跨入了臨床應(yīng)用干細(xì)胞治療的時(shí)代，有理由相信隨著研究的深入和應(yīng)用的推廣，一定會(huì)將組織工程化軟骨更好的應(yīng)用于臨床。

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