針刺夾脊穴對大鼠椎間盤LI-1α、TNF-β濃度及MRI影像影響的實(shí)驗(yàn)研究*

吳 曦，劉鳳閣，楊建業(yè)，張自力，董軍立

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北十堰442000)

傳統(tǒng)中醫(yī)針灸作為腰椎間盤突出癥(Lumber disc herniation，LDH)重要的治療手段之一，在臨床上使用廣泛，筆者于2011年12月至2012年2月通過針刺腰椎間盤突出癥大鼠模型夾脊穴進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察針刺夾脊穴對腰椎間盤突出癥大鼠椎間盤LI-1α、TNF-β濃度及MRI影像的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康3月齡雄性SPF級SD大鼠30只，體重(200±20)g，來源于湖北十堰市動物實(shí)驗(yàn)中心，來源號NO.00021069，按1～30編號后，使用隨機(jī)排列表法將大鼠隨機(jī)分為針刺干預(yù)組(A組)10只、對照組(B組)10只、正常組(C組)10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

常用注射器5號針頭(距針尖3 mm處有限位器)，常用動物實(shí)驗(yàn)手術(shù)器械，蘇州華佗牌一次性針灸針(直徑0.3 mm)，美國 GE1.5TMRI成像系統(tǒng)，南京建成生物研究所LI-1α、TNF-β試劑盒(批號為：20111224、20111219)。

1.3 方法

1.3.1 動物造模及干預(yù)

A組：禁食水1天，逐只行SPF級別手術(shù)。方法：10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉，麻醉滿意后俯仰臥位固定鼠板，腹部備皮，消毒，鋪巾。腹部正中切口(以髂嵴最高點(diǎn)為切口中點(diǎn)，長1.5 cm)，分層切開腹壁，分離腹膜，用玻璃棒將腹腔腸管推至右側(cè)，可見腹主動脈、后腔靜脈、髂腰動靜脈，鈍性分離后腹膜，后用玻璃棒將上述血管予以保護(hù)，后剝離L5～6、L6～S1兩椎間盤左側(cè)腰大肌、韌帶及骨膜，暴露椎間盤左前緣，后用5號針頭(帶限位器)分別刺入上述椎間盤3 mm后退針。后生理鹽水1 ml、氨芐西林100 mg灌洗腹腔，分層縫合，消毒，無菌敷料創(chuàng)口，待大鼠復(fù)醒后禁食水12 h，每日皮下注射氨芐西林50 mg，連續(xù)3天。術(shù)后分籠飼養(yǎng)4周后，取大鼠雙側(cè)L5、L6夾脊穴(脊柱正中旁開3 mm)，直刺0.5 mm，行平補(bǔ)平泄手法3次后，留針持續(xù)20 min。每天1次，連續(xù)10天。

B組：造模方法同A組，不干預(yù)，正常分籠飼養(yǎng)。

C組：不行造模及干預(yù)，正常分籠飼養(yǎng)。

1.3.2 MRI檢查

造模后及干預(yù)后隨機(jī)(隨機(jī)排列表法)選取A組、B組、C組大鼠各5只，10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉后膠布固定于紙板上，行MRI檢查(矢狀位)。參數(shù)：T2WI：TR 值 2960.0 ms，TE 值 102.6 ms，F(xiàn)OV120 mm，層厚3 mm。參照 Thompson標(biāo)準(zhǔn)［1］，將退變椎間盤分為4級：1級：T2WI信號正常;2級：T2WI信號輕度減低;3級：T2WI信號中度減低;4級：T2WI信號明顯減低。測量椎間盤高度：測量L5～6、L6～S1椎間盤上下緣中點(diǎn)連線長度。

1.3.3 椎間盤LI-1α、TNF-β酶聯(lián)免疫檢測

完成MRI檢查后，所有大鼠全部麻藥過量處死，取 L5～6、L6～S1椎間盤及終板，剔除附著組織，大量PBS緩沖液沖洗后，放在-80℃冰箱保存。后集中取出，稱重后分別放置研缽中，分3次反復(fù)加入液氮共約20 ml，研碎，加入PBS緩沖液1 ml后離心(10 000轉(zhuǎn)/min、持續(xù)10 min)，取上清液。ELISA操作步驟按試劑盒說明逐步完成，后450 mm波長測量測試各孔吸光度(OD值)。記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算樣品濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差，檢驗(yàn)方法采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠椎間盤MRI檢查

2.1.1 大鼠 L5～6、L6～S1椎間盤 MRI分級

表1 A、B、C 各組造模后、干預(yù)后 L5～6、L6～S1椎間盤MRI分級對照

由表1可見A、B組在造模后及干預(yù)后無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)后大鼠椎間盤MRI表現(xiàn) 見封三圖1、2、3。圖1正常組MRI可見 L5～6、L6～S1椎間盤高度正常，椎間隙未見明顯狹窄，無椎間盤突出。圖2針刺干預(yù)組MRI表現(xiàn)為L5～6、L6～S1椎間盤信號明顯降低，間盤內(nèi)含水量明顯降低，椎間盤高度下降，椎間隙變窄，椎間盤后緣部分向椎管內(nèi)突出，同時(shí)L5、L6、S1椎體部分信號降低。圖3對照組MRI表現(xiàn)與圖2表現(xiàn)基本相同。

2.1.3 大鼠 L5～6、L6～S1椎間盤高度比較

表2 A、B、C各組造模后、干預(yù)后椎間盤高度對照 (mm)

由表2可見，A、B 兩組 L5～6、L6～S1椎間盤在造模后、干預(yù)后無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

2.2 大鼠椎間盤內(nèi)LI-1α、TNF-β濃度比較

表3 LI-1α、TNF-β濃度對照A、B、C各組干預(yù)后椎間盤

由表3可見，干預(yù)后A組與B組大鼠椎間盤LI-1α、TNF-β 濃度有顯著差異(P ＜0.01)。

3 討論

華佗夾脊穴(簡稱夾脊穴)，從古至今備受歷代醫(yī)家重視，夾脊穴的應(yīng)用最早見于《素問·刺瘧》：“十二瘧者，……又刺項(xiàng)以下俠脊者必已”?！端貑枴た姶陶摗芬嘣唬骸靶翱陀谧闾栔j(luò)，令人拘攣背急，引脅而痛，刺之從項(xiàng)始數(shù)脊椎俠脊，疾按之應(yīng)手如痛，刺之旁三瘠”。根據(jù)穴位的近治、遠(yuǎn)治作用，腰夾脊穴電針可以作用于局部即腰椎、椎間盤、附近肌肉神經(jīng)等(近治)，也可通過足太陽膀胱經(jīng)聯(lián)系作用于下肢尤其是下肢后側(cè)、后外側(cè)區(qū)域(遠(yuǎn)治)。同時(shí)現(xiàn)代解剖證實(shí)腰夾脊穴位置在腰骨纖維孔、骨纖維管等結(jié)構(gòu)附近，上述結(jié)構(gòu)分別行走腰神經(jīng)后支、腰神經(jīng)后內(nèi)側(cè)支。

腰椎間盤突出癥機(jī)制尚未完全明確，傳統(tǒng)單純考慮機(jī)械性壓迫因素，但目前大量研究證實(shí)，其化學(xué)性炎癥介質(zhì)、免疫性炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子(CK)及神經(jīng)源性炎癥介質(zhì)在其發(fā)生中起重要作用［2］。目前普遍認(rèn)為化學(xué)性刺激、炎性介質(zhì)浸潤、免疫反應(yīng)、機(jī)械性壓迫等因素共同參與腰椎間盤突出癥的發(fā)病。而LI-1β、TNF-α則是與腰椎間盤突出癥、腰椎間盤退變密切相關(guān)的細(xì)胞因子。LI-1β是一種主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的重要細(xì)胞因子，具有廣泛的生物學(xué)活性，主要在細(xì)胞免疫中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，其作為炎癥介質(zhì)具有細(xì)胞損傷、破壞作用，Solovieva等［3］對IL-1多分子聚體和椎間盤的退變關(guān)系的相關(guān)性進(jìn)行了研究，認(rèn)為其是椎間盤退變的始動因素。TNF-α主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)等作用。田華等［4］通過大鼠軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)證實(shí)，TNF-α能明顯促進(jìn)軟骨細(xì)胞MMPI及MMP3的表達(dá)，對TIMPI的表達(dá)無影響，因此TNF-α對椎間盤細(xì)胞(軟骨細(xì)胞)具有一定損傷作用。

MRI可以進(jìn)行矢狀位、冠狀位、橫截面等多平面成像，能對椎間盤退行性變進(jìn)行早期評估，是目前椎間盤退變最精確、最簡便而又無創(chuàng)性的檢查方法［5～6］。隨著MRI技術(shù)的普及，該技術(shù)越來越多的應(yīng)用于臨床及動物實(shí)驗(yàn)。椎間盤退變時(shí)，隨著椎間盤病例損傷的發(fā)生、水分、含氫量的改變，導(dǎo)致其形態(tài)和MRI信號減低，以T2加權(quán)限最為敏感，故該技術(shù)可以精確的反映腰椎間盤突出癥椎間盤在形態(tài)學(xué)上的變化，亦能相對精確的反映椎間盤含水量(含氫量)。

筆者通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)針刺夾脊穴對腰椎間盤突出癥大鼠椎間盤內(nèi)LI-1α、TNF-β濃度有明顯的抑制作用。同時(shí)證實(shí)短期內(nèi)(4周)針刺夾脊穴對腰椎間盤突出癥大鼠椎間盤高度、退變程度無明顯影響，與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這在一定程度上證實(shí)了臨床針刺夾脊穴治療腰椎間盤突出癥一個(gè)常見問題：部分患者針刺前后雖然影像學(xué)檢查無明顯差異(突出物位置、突出程度、突出物大小)，但癥狀能夠得到一定控制，可能與椎間盤及椎管內(nèi)炎性因子受到抑制，進(jìn)而椎間盤內(nèi)及椎管內(nèi)炎癥反應(yīng)減輕、神經(jīng)根損害減輕相關(guān)。但針刺夾脊穴對腰椎間盤突出癥椎間盤遠(yuǎn)期病理進(jìn)程影響、遠(yuǎn)期MRI形態(tài)影響未能涉及，可在今后進(jìn)一步研究。

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