冬蟲夏草發(fā)酵技術(shù)的研究進(jìn)展*

勞景輝，閆文娟，方佳茂，陳偉濱

(1.廣東省微生物研究所，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室，廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室，廣東省華南應(yīng)用微生物重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，廣東 廣州 510070；2.廣東迪美生物技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510070；3.廣東環(huán)西生物科技股份有限公司，廣東 揭陽 515343)

冬蟲夏草Ophiocordyceps sinensis(Berk.)G.H.Sung,J.M.Sung,Hywel-Jones&Spatafora，是線蟲草科（Ophiocordycipitaceae）、線蟲草屬（Ophiocordyceps）的蟲生真菌[1]，寄生于蟲草蝙蝠蛾幼蟲體上，由蟲形菌核（僵蟲）和子座（草部）組成。由于冬蟲夏草具有多種的藥理活性，如抗腫瘤、抗疲勞、抗氧化和提高免疫力等[2]，一直被視為珍貴的中藥材而得到廣泛的應(yīng)用。但鑒于天然冬蟲夏草對生長環(huán)境要求高，生長率低，加之人們對其需求的日益增加，使得野生的冬蟲夏草資源緊缺，其價格甚至比黃金還高。因此，以發(fā)酵等方法探索對冬蟲夏草進(jìn)一步開發(fā)利用的新途徑成為了研究的熱點。本文從冬蟲夏草發(fā)酵無性型菌株的鑒定及篩選、液體發(fā)酵工藝的優(yōu)化、固體發(fā)酵技術(shù)的開發(fā)和發(fā)酵產(chǎn)物的評價及應(yīng)用等方面對冬蟲夏草發(fā)酵進(jìn)行了綜述。

1 冬蟲夏草發(fā)酵菌株的研究概況

發(fā)酵研究的關(guān)鍵之一是要采用真正的冬蟲夏草菌株。由于部分早期研究沒有考慮到冬蟲夏草不適應(yīng)高溫、生長緩慢等特點，加上其它技術(shù)上的原因，致使部分用于發(fā)酵研究的“冬蟲夏草”菌株其實只是長于冬蟲夏草上的其它菌。但隨著對冬蟲夏草的認(rèn)識不斷加深及相關(guān)研究技術(shù)的發(fā)展，真正的冬蟲夏草開始被廣泛研究。1977年，沈南英開始對冬蟲夏草生態(tài)進(jìn)行研究，2年后成功分離到冬蟲夏草菌種（該菌種的無性型后被證明為中國被毛孢）[2]，并于1983年首次發(fā)表了有關(guān)該真菌菌種分離研究的論文[3]。1989年劉錫進(jìn)

王等分離到與沈南英相同的冬蟲夏草菌種無性型，定名為中國被毛孢（Hirsutella sinensis X.J.Liu,Y.L.Guo,Y.X.Yu&W.Zeng） 并正式發(fā)表[4]。1999年趙錦等從分子生物學(xué)角度證明冬蟲夏草無性階段是中國被毛孢[5]，并于2000年把該鑒定方法申請中國專利，即鑒別冬蟲夏草的特征性核苷酸序列和方法（CN00114160.0）。2004年蔣毅等認(rèn)為中國被毛孢與天然冬蟲夏草菌種一致[6]。2005年中國菌物學(xué)會再次確認(rèn)冬蟲夏草菌的無性型是中國被毛孢。至于冬蟲夏草的有性型名稱，過去曾長時間采用Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.的拉丁學(xué)名，到2007年則變?yōu)镺phiocordyceps sinensis(Berk.)G.H.Sung,J.M.Sung,Hywel-Jones&Spatafora[1，7]，中文可譯為中國線蟲草 （即冬蟲夏草）。本文采用了這一新的拉丁學(xué)名。

近年來報道從冬蟲夏草上分離出來的無性型有很多，但只有中國被毛孢（Hirsutella sinensis）經(jīng)接種蝙蝠蛾幼蟲，并完成了從染菌直到長出子實體的全過程，證明是冬蟲夏草的無性型菌株[8]，而冬蟲夏草頭孢（Cephalosporium dongchongxiacae N.Y.Shen,S.M.Zhang,L.Zeng,X.C.Zhang&S.L.Wei）、蟲草頭孢（Cephalosporium sinensis C.T.Chen）、蝙蝠蛾被毛孢（Hirsutella hepiali C.T.Chen&N.Y.Shen） 和中華束絲孢（Synnematium sinense X.C.Yin&N.Y.Shen） 等也已被證明是中國被毛孢（H.sinensis）的同物異名[9，10]，而其它更多的發(fā)酵菌株則尚未確定是中國被毛孢（H.sinensis），因此相關(guān)的研究還需繼續(xù)進(jìn)行，而本文所綜述的發(fā)酵研究，均基于可靠的菌種來源或其菌株符合冬蟲夏草的生長規(guī)律。

2 冬蟲夏草液體發(fā)酵的研究概況

菌絲體干重是冬蟲夏草液體發(fā)酵條件及培養(yǎng)基篩選的主要指標(biāo)之一。張忠廣等發(fā)現(xiàn)在pH 5.5、裝量40%、溫度18℃～20℃、轉(zhuǎn)速 100 r·min-1～120 r·min-1、培養(yǎng)時間 96 h的適宜條件下，以S31培養(yǎng)基和a培養(yǎng)基，對冬蟲夏草菌進(jìn)行液體發(fā)酵，得到的菌絲干重達(dá)0.028 g·mL-1左右[11]。多糖作為冬蟲夏草的重要有效成分之一，其產(chǎn)量也常被作為實驗的評價指標(biāo)。全衛(wèi)豐等以產(chǎn)胞外多糖為參考指標(biāo)，對冬蟲夏草液體發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基配比為蔗糖3%、玉米粉5%、豆餅粉4%、七水硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.1%、維生素B1為0.01%，于22℃、pH 6.5、轉(zhuǎn)速120 r·min-1，搖瓶培養(yǎng)7 d，所得胞外粗多糖產(chǎn)量為5.86 g·L-1[12]；張國英對冬蟲夏草無性型菌株中國被毛孢進(jìn)行了原生質(zhì)體的紫外誘變育種，以菌絲體濕重和多糖含量為指標(biāo)，篩選出誘變菌株M1069#，通過鑒定后對其進(jìn)行培養(yǎng)基單因素實驗和優(yōu)化實驗，得出最優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，實驗后得到的菌絲體含量達(dá)6.31 g·瓶-1，多糖含量為12.1%[13]。

近年來，Dong等對冬蟲夏草深層發(fā)酵進(jìn)行單因素和正交實驗，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中含有蔗糖、蛋白胨、維生素B、鈣、鋅和碳氮比為12∶1時是最有利于菌絲體生長的，而蔗糖、蛋白胨和酵母提取物的最佳濃度分別是50 g·L-1、10 g·L-1和3 g·L-1，經(jīng)過40 d的發(fā)酵，所得的菌絲體生物量超過22 g·L-1[14]；隨后，Dong等又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)6株冬蟲夏草菌株的最適生長溫度范圍是15℃～18℃，超過21℃時則生長緩慢，達(dá)25℃及以上溫度時便會停止生長；而冬蟲夏草的生長周期即使在最佳條件下，依然相對較長，其液體發(fā)酵也經(jīng)歷延滯期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和死亡期，當(dāng)中的對數(shù)生長期更是長達(dá)10 d，如果以菌絲體作為目標(biāo)產(chǎn)物，則整個發(fā)酵周期需25 d～30 d[15]。

3 冬蟲夏草固體發(fā)酵的研究概況

3.1 固體發(fā)酵概述

相對于液體發(fā)酵技術(shù)，固體發(fā)酵的設(shè)備較為簡單，而且廢液排放少，有利于減輕環(huán)境污染及生產(chǎn)成本控制，并且其后處理相對簡單，只需將發(fā)酵物干燥粉碎即可，可避免液體發(fā)酵技術(shù)工藝復(fù)雜、容易污染和設(shè)備投資大等缺點。另外，固體發(fā)酵對于某些研究材料來說，可以比液體發(fā)酵的產(chǎn)量有所提高，而且該發(fā)酵方式特別適合于絲狀真菌[16]，因此，真菌的固體發(fā)酵技術(shù)已逐漸得到人們的重視，但有關(guān)冬蟲夏草固體發(fā)酵的研究卻少有報道。

3.2 冬蟲夏草固體發(fā)酵及其應(yīng)用研究

葛飛等以麥角甾醇含量為指標(biāo)，對冬蟲夏草無性型，即中國被毛孢的固體發(fā)酵進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)固體發(fā)酵最佳培養(yǎng)基為大米5 g、玉米粉2 g、蠶蛹粉1 g、麥麩2 g，適宜的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度20℃、料水比1∶1.5、料層厚度2 cm，且無光照時對菌絲生長較為有利，所得菌絲體的麥角甾醇含量較未優(yōu)化的提高了38.6%[17]。Zhang等發(fā)現(xiàn)陳米經(jīng)過冬蟲夏草菌的發(fā)酵后，其營養(yǎng)物質(zhì)如蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、膳食纖維、維生素E、氨基酸和麥角甾醇等都高于發(fā)酵前的陳米，而且提高了其超氧化物歧化酶的活性，為陳米的有效利用提供了一種新方法[18]；王祥誠等利用冬蟲夏草菌來發(fā)酵蕨渣，生產(chǎn)菌質(zhì)多糖，發(fā)現(xiàn)最佳工藝條件為蕨渣比例85%、基質(zhì)含水量60%、培養(yǎng)溫度22℃，而且基質(zhì)含水量偏低有利于菌絲生長，如果偏高則菌質(zhì)多糖得率偏高[19]。閆文娟等對冬蟲夏草固體發(fā)酵物的抗疲勞作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)灌胃喂養(yǎng)冬蟲夏草固體發(fā)酵物水提液的小鼠，負(fù)重游泳時間顯著延長[20]。

4 冬蟲夏草發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量評價

王尊生等對冬蟲夏草菌絲體固體發(fā)酵粉進(jìn)行成分分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵粉中3'-脫氧腺苷、甘露醇的含量明顯高于冬蟲夏草子實體中相應(yīng)成分的含量；各種氨基酸的含量和水平，與冬蟲夏草子實體中相應(yīng)的氨基酸的含量和水平相當(dāng)；發(fā)酵粉中的其他化學(xué)成分和冬蟲夏草子實體中相應(yīng)成分基本一致[21]。丁婷等發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草無性型菌株發(fā)酵液中核苷類成分分別為腺苷、尿苷、鳥苷，其含量均高于對照品冬蟲夏草生藥[22]。王英超等對冬蟲夏草菌液體發(fā)酵過程中的酶活性進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)淀粉酶、糖化酶、中性及酸性蛋白酶的活力均隨反應(yīng)時間的延長而逐漸增加[23]。Li等研究表明，現(xiàn)在對冬蟲夏草及制品的檢測指標(biāo)主要有核苷、麥角甾醇、甘露醇和多糖等化合物，而另一種方法則是通過比對相應(yīng)組分的化學(xué)圖譜來對冬蟲夏草進(jìn)行質(zhì)控，如CE（毛細(xì)管電泳）等，相對于對單個化合物的鑒定，這種方法更為方便可行[24]。

5 小結(jié)與討論

綜上所述，目前對冬蟲夏草發(fā)酵的研究主要包括菌株的篩選、液體發(fā)酵工藝的摸索、固體發(fā)酵技術(shù)的開發(fā)和發(fā)酵產(chǎn)物的評價及應(yīng)用幾個方面，其中確定研究菌株是否是真正的冬蟲夏草無性型（中國被毛孢）成為其中最關(guān)鍵的問題之一。近年來，有許多關(guān)于冬蟲夏草發(fā)酵研究的報道，但當(dāng)中有很多的研究結(jié)果不太一致，如培養(yǎng)溫度的選擇，范圍從18℃～30℃都有報道，如吳彩琴等的研究[25]；培養(yǎng)時間的長短，范圍從48 h～40 d也有報道，但冬蟲夏草是一種生長緩慢，且生長溫度相對較低的真菌，所以溫度和生長周期應(yīng)該是其重要的研究考慮因素[15，26]，而很多研究都忽略了這一點，也缺乏對研究菌株的鑒定，因此，相關(guān)研究的菌株可靠性還需要進(jìn)一步證實。出現(xiàn)上述情況可能有以下幾個原因：第一，可能研究菌株并非真正的冬蟲夏草；第二，可能該冬蟲夏草菌株經(jīng)過改良，已經(jīng)可以適應(yīng)相對較高的溫度；第三，該實驗可能只在該次實驗條件下成立。對此，僅對有可靠菌種來源或從培養(yǎng)溫度和時間上符合冬蟲夏草生長規(guī)律的發(fā)酵研究進(jìn)行綜述。

鑒于冬蟲夏草對生長環(huán)境和培養(yǎng)條件的苛刻要求，分離出真正的菌種是非常關(guān)鍵的，而目前人們對冬蟲夏草的研究主要是集中于其藥理活性的開發(fā)，各種與冬蟲夏草相關(guān)的制品在保健品市場隨處可見，如百令膠囊、金水寶膠囊、寧心寶膠囊、至靈膠囊和心肝寶膠囊等。但研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)中某些產(chǎn)品的確是用冬蟲夏草的無性型來生產(chǎn)的，但也有一些是來源于天然冬蟲夏草菌菌體上分離到的其它菌類，并非真正的冬蟲夏草菌[27]。當(dāng)然并不否認(rèn)，從冬蟲夏草菌體上分離到的某些非冬蟲夏草無性型的其它真菌也會有很好的保健或藥用功效，如蝙蝠蛾擬青霉。但從科學(xué)的角度來看，這些研究與真正的冬蟲夏草菌種關(guān)系不甚密切。所以，進(jìn)行對冬蟲夏草的研究之前，對研究菌株進(jìn)行鑒定是很有必要的。分子生物學(xué)方法是鑒定冬蟲夏草無性型的有效方法之一[9]，只要能以科學(xué)的態(tài)度去對待研究及生產(chǎn)上所采用的“冬蟲夏草”菌種問題，通過分子生物學(xué)等技術(shù)手段，則可對冬蟲夏草的發(fā)酵研究有更深入的認(rèn)識。

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