蛋白質(zhì)組學(xué)及其在眼表疾病中的相關(guān)研究

黃霏霏 張朝然

隨著人類基因組計(jì)劃的完成，蛋白質(zhì)組學(xué)已悄然成為后基因時(shí)代的研究熱點(diǎn)。與基因組相比，生物體的復(fù)雜性及多樣性更多的是由蛋白質(zhì)決定，而傳統(tǒng)的對(duì)單個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行研究的方法已無(wú)法滿足后基因組時(shí)代的要求，因此大規(guī)模、全方位的蛋白質(zhì)研究勢(shì)在必行，蛋白質(zhì)組學(xué)也由此誕生。本文主要對(duì)基本概念、研究方法及其在眼表疾病的應(yīng)用等方面的新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)的背景和概念

蛋白質(zhì)組是一個(gè)基因組或一個(gè)細(xì)胞、組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)，不僅包括基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接翻譯的蛋白質(zhì)，還包括轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物選擇剪接后所編碼的蛋白質(zhì)以及翻譯后修飾的蛋白質(zhì)等?；蚪M對(duì)于生物體來(lái)說是相對(duì)恒定的［1］，是對(duì)生物功能的靜態(tài)分析。而從基因到蛋白質(zhì)還存在翻譯調(diào)節(jié)以及翻譯后的加工修飾等多個(gè)步驟，mRNA的水平與蛋白質(zhì)的表達(dá)并不存在直接關(guān)系［2］。因此，要更好地了解機(jī)體各項(xiàng)機(jī)制，就必須對(duì)機(jī)體功能的直接執(zhí)行者蛋白質(zhì)進(jìn)行深入的研究。1994年蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)的概念被首次提出，它是指從整體出發(fā)，研究動(dòng)態(tài)變化的生物體所有蛋白質(zhì)組成、表達(dá)和修飾狀態(tài)等，分析蛋白質(zhì)之間及其與藥物之間的相互作用，更深刻地探索不同生理、病理狀態(tài)下的生命活動(dòng)規(guī)律［3］。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法

蛋白質(zhì)組學(xué)基本技術(shù)流程包括從生物樣品中提取蛋白質(zhì)，將蛋白混合物分離、染色，得到蛋白質(zhì)表達(dá)譜;運(yùn)用計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定位、定量及差異點(diǎn)尋找;最后鑒定蛋白質(zhì)種類及肽序列。目前，電泳技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中大規(guī)模自動(dòng)化鑒定蛋白質(zhì)組的主要手段。

二維電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的一個(gè)里程碑，也是目前常用的蛋白質(zhì)分離技術(shù)［4］。通過將等電點(diǎn)電泳與聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合，依據(jù)等電點(diǎn)不同在第一相等電聚焦電泳分離蛋白質(zhì)，接著再根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量不同，在第二相十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠上分離蛋白質(zhì)。質(zhì)譜是依據(jù)分離出的蛋白質(zhì)理化特性、肽段序列特征進(jìn)行識(shí)別和鑒定蛋白質(zhì)，敏感度高，通量高，準(zhǔn)確性強(qiáng)，可自動(dòng)化操作，且可用于翻譯后修飾的分析。質(zhì)譜分析的原理是通過測(cè)量質(zhì)荷比(mass－to－charge ratio，M/Z)的差異來(lái)確定樣品分子的質(zhì)量，再在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中查找對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)［5］。目前常用的質(zhì)譜技術(shù)包括:基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(matrix assisted laser desorption in ionation－time of flight－mass spectrometry，MALDI－TOF－MS)，電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)(electro－spray ionization mass spectrometry，ESI－MS)，表面增強(qiáng)激光解析/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(surface－enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，SELDI－TOFMS)，同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(isobariCTag for relative and absolute quantitation，Itraq)等［6］。

3 眼表疾病的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

眼表包括角膜上皮、結(jié)膜上皮和淚膜3個(gè)部分。淚膜是覆蓋于眼球表面的一層液體，對(duì)維持眼的正常結(jié)構(gòu)、功能具有重要作用。淚膜和淚液中含有多種蛋白質(zhì)，它們的異常表達(dá)常與眼表疾病相關(guān)聯(lián)。de Souza等［7］運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)淚液蛋白進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果顯示在鑒定的491種蛋白中，包括64種蛋白酶或蛋白酶抑制物、18種抗氧化酶。這些蛋白酶不僅在保護(hù)眼表免受外界環(huán)境不良因素的損害方面發(fā)揮重要作用，其蛋白酶之間作用的平衡對(duì)維持眼表正常生理微環(huán)境也極其重要。因此，淚液中全部蛋白質(zhì)的研究對(duì)于闡明眼部疾病的分子機(jī)制非常有用。

3.1 干眼癥 干眼癥是眼科的常見病、多發(fā)病，發(fā)病率為11%～22%［8］。目前將其定義為由于淚液生成不足或蒸發(fā)過強(qiáng)導(dǎo)致的淚膜不穩(wěn)定和眼表?yè)p害，主要表現(xiàn)為眼部不適、視覺模糊［9］。臨床上干眼癥多采取淚液分泌試驗(yàn)、淚膜破裂時(shí)間等檢查，但這些檢查并不能很好闡明干眼癥的發(fā)病機(jī)制及其病理生理過程。淚液的收集是無(wú)創(chuàng)性的。若能將收集的淚液進(jìn)行相關(guān)蛋白質(zhì)組的分析，無(wú)論是對(duì)發(fā)病機(jī)制的研究，還是臨床診斷、治療及療效評(píng)估，都有非常重要的意義。

原發(fā)性 Sj?gren 綜合征(primary Sj?gren Syndrome，p－SS)是引起淚液生成不足型干眼癥的主要病因。目前導(dǎo)致淚腺分泌功能障礙的機(jī)制不明［10］，臨床確診時(shí)多為晚期。Tomosugi等［11］用 SELDI－TOF－MS 對(duì) p－SS 患者的淚液蛋白進(jìn)行分析，并尋找可信的生物標(biāo)記物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，p－SS患者的淚液中有7種蛋白的峰值下降，3種上升。下調(diào)的蛋白包括溶菌酶和前白蛋白。對(duì)發(fā)生損害的眼表上皮進(jìn)行虎紅染色后發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)峰值的下降程度與虎紅染色評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。該試驗(yàn)結(jié)果的特異性為100%，可以補(bǔ)償傳統(tǒng)檢查出現(xiàn)假陰性的可能。SELDI－TOF－MS所需的樣本少，且為非侵入性，提高了臨床早期診斷p－SS的可行性。

淚液蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼癥是瞼板腺功能異常及脂質(zhì)缺乏導(dǎo)致的。Versura等［12］對(duì)中度蒸發(fā)型干眼癥患者淚液中的蛋白質(zhì)組進(jìn)行分離，并用免疫印跡和酶譜分析對(duì)相應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多種與淚膜穩(wěn)定性密切相關(guān)的蛋白質(zhì)的量發(fā)生改變。在患者的淚液中，脂鈣蛋白和親脂蛋白含量降低，并且它們的實(shí)際水平與淚膜破裂時(shí)間及眼部的不適癥狀相關(guān)，提示這兩種蛋白含量的減少可能導(dǎo)致淚膜穩(wěn)定性變差。脂鈣蛋白還可清除淚液中多余的脂質(zhì)分子，它含量的降低會(huì)導(dǎo)致淚液中有害脂質(zhì)增多。結(jié)膜血管通透性異常導(dǎo)致血清白蛋白滲入淚液，即便在早期患者的淚液中，白蛋白含量也已顯著升高。Tong等［13］通過 iTRAQ技術(shù)發(fā)現(xiàn)，患者淚液中 S100A8蛋白與S100A9蛋白顯著升高，它們的改變與瞼板腺導(dǎo)管上皮角化有關(guān)，還反映了眼紅、視力模糊等癥狀的程度。因此，進(jìn)行淚液中蛋白質(zhì)組分改變的相關(guān)研究，對(duì)于進(jìn)一步闡明淚液蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼癥的發(fā)病機(jī)制有著重要意義。

糖尿病患者干眼癥的發(fā)病率遠(yuǎn)高于正常人群，其嚴(yán)重性與糖尿病程度成正比［14］。Herber等［15］用二維電泳技術(shù)和矩陣分析法對(duì)2型糖尿病所致的干眼癥患者淚液中蛋白組分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組淚液蛋白的種類和峰值均明顯高于對(duì)照組。后者主要是由糖基化蛋白增加所致，如白蛋白的糖基化。蛋白質(zhì)糖基化可改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，從而引起眼表疾病。淚液中蛋白質(zhì)改變能否作為糖尿病并發(fā)干眼癥的診斷手段?蛋白質(zhì)的變化是由糖尿病本身引起還是由糖尿病性代謝紊亂激發(fā)導(dǎo)致?與其他眼表疾病相比發(fā)現(xiàn)糖尿病并發(fā)干眼癥的相關(guān)特異蛋白，這些都是今后研究中亟待解決的問題。

3.2 圓錐角膜 圓錐角膜是角膜異常膨脹、增厚所致，多起病于青少年。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為圓錐角膜是一種非炎癥性疾病，但近期研究［16］提示可能有炎性因子和免疫因素參與其發(fā)病機(jī)制。Pannebaker等［17］采集佩戴透氣性角膜接觸鏡和未佩戴的圓錐角膜患者以及正常人的淚液，對(duì)3組淚液中蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)圓錐角膜患者淚液中基質(zhì)金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1，MMP1)升高。MMP1是一種可降解細(xì)胞外機(jī)制的酶，可以特異性破壞角膜膠原1和角膜膠原3。細(xì)胞骨架角蛋白含量也增高，提示圓錐角膜的形成可能與角膜病理性角化有關(guān)。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體1(tumor necrosis factorrelated apoptosis－inducing ligand 1，TRAIL－R1)的不恰當(dāng)表達(dá)可能也與圓錐角膜存在相互關(guān)聯(lián)。乳腺球蛋白B可與疏水性配體結(jié)合并參與淚膜脂質(zhì)層的形成，它在圓錐角膜中的表達(dá)增高。Lema等［18］運(yùn)用二維電泳和質(zhì)譜技術(shù)，發(fā)現(xiàn)圓錐角膜患者淚液中鋅－α2－糖蛋白(zinc－α2－glycoprotein，ZAG)、免疫球蛋白 κ恒定區(qū)(immunoglobulin kappa constant，IGKC)的表達(dá)均低于正常人。乳鐵蛋白可以抑制前炎性因子(IL－6，TNF－α，IL－1－β，IL－8)和膠原酶的作用，是保護(hù)性因子。IGKC參與組成抗體的輕鏈，并與免疫應(yīng)答相關(guān)。IGKC的改變提示圓錐角膜的發(fā)生可能有免疫因素參與。ZAG的作用目前尚不清楚。

3.3 結(jié)膜松弛癥 結(jié)膜松弛癥(conjunctivachalasis，CCH)是由于球結(jié)膜過度松弛造成球結(jié)膜堆積在眼球與下瞼緣，引起一系列眼表不適，如刺激、疼痛、溢淚、干眼等。對(duì)CCH患者淚液進(jìn)行蛋白質(zhì)組的研究，對(duì)闡明發(fā)病機(jī)制及選擇臨床治療手段都具有重要意義。Acera等［19］發(fā)現(xiàn) CCH 患者淚液中mmP9、IL－1、IL－6等炎性因子表達(dá)均有升高，提示CCH的發(fā)生與炎癥參與密切相關(guān)。進(jìn)一步研究顯示促進(jìn)MMP9合成的S100－A4蛋白在CCH患者淚液中也有增加。此外，與細(xì)胞骨架合成、降解相關(guān)的蛋白，以及與纖維化相關(guān)的蛋白質(zhì)在CCH中也均有上調(diào)［20］。

3.4 角膜移植排斥反應(yīng) 角膜排斥反應(yīng)是導(dǎo)致角膜移植失敗的最主要原因。角膜本身無(wú)血管，其營(yíng)養(yǎng)代謝主要來(lái)自房水、淚膜、角膜緣血管，因此角膜自身的變化與房水、淚膜及血液成分的改變必定密切相關(guān)。

Funding等［21］對(duì)急性角膜移植免疫排斥患者的房水進(jìn)行研究，首先用Bradford法對(duì)房水中蛋白總量進(jìn)行測(cè)定，再用二維電泳分離房水蛋白，接著用免疫印跡標(biāo)記白蛋白，最后對(duì)剩下的房水蛋白采用MALDI－TOF－MS進(jìn)行鑒定檢驗(yàn)。結(jié)果顯示共有31種標(biāo)記蛋白明顯上升，它們來(lái)源于白蛋白、α1－抗胰蛋白酶、載脂蛋白J、細(xì)胞角蛋白－II、絲氨酸蛋白酶抑制劑。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，角膜移植排斥反應(yīng)中房水蛋白組成發(fā)生改變的機(jī)制至少有3點(diǎn):①血－房水屏障的破壞導(dǎo)致血漿中白蛋白進(jìn)入房水;②房水中發(fā)現(xiàn)的白蛋白片段提示房水中存在特異性水解白蛋白的酶類;③α1抗胰蛋白酶的增加是由移植角膜自身合成釋放的，并非由于血－房水屏障破壞引起，它具有保護(hù)移植角膜免受免疫排斥反應(yīng)的作用。

3.5 眼表重建 完整的角膜上皮細(xì)胞、角膜無(wú)血管、規(guī)則排列的基質(zhì)膠原纖維共同保障角膜的透明性，角膜緣干細(xì)胞可維持角膜上皮的不斷更新，同時(shí)防止角膜結(jié)膜化、新生血管長(zhǎng)入等一系列影響角膜透明因素的發(fā)生［22］，而眼表化學(xué)傷、熱灼傷等可破壞角膜緣干細(xì)胞功能。目前主要的治療方法是進(jìn)行角膜緣干細(xì)胞移植［23］。Echevarria等［24］運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)角膜緣基質(zhì)中的玻璃黏蛋白對(duì)于維持角膜緣干細(xì)胞的活性有重要意義。Lyngholm等［25］在對(duì)角膜緣干細(xì)胞標(biāo)志物的進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)，僅在角膜緣基底細(xì)胞層中低分化的干細(xì)胞中存在超氧化物歧化酶2，此外，細(xì)胞角蛋白15也只存在于角膜緣基底細(xì)胞層中［25－26］。

目前一種新興的眼表重建手段是通過生物工程技術(shù)使角膜緣干細(xì)胞在體外培養(yǎng)基上增殖后，再移植至眼表，而羊膜則是一種良好的基質(zhì)。通過對(duì)培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞完整羊膜的蛋白組研究［27］顯示，上調(diào)的熱休克蛋白70－1可通過增加凋亡和ADP聚合酶裂解來(lái)促進(jìn)干細(xì)胞增殖。Baharvand等［28］用MALDI－TOF－MS技術(shù)對(duì)去上皮的羊膜進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人基膜聚糖和骨甘氨酸含量增加。它們參與調(diào)節(jié)膠原纖維的增殖，骨甘氨酸更與細(xì)胞增殖、血管生成、炎癥反應(yīng)等的調(diào)控相關(guān)，因此，去上皮的羊膜也為角膜緣干細(xì)胞的增殖和維持其正常表型提供了適合的微環(huán)境。

4 展望

近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究呈現(xiàn)突飛猛進(jìn)的發(fā)展，但關(guān)于眼部的研究并不多。部分原因是由于眼部結(jié)構(gòu)精細(xì)、取樣風(fēng)險(xiǎn)大，尤其在健康對(duì)照組內(nèi)，很多諸如穿刺等操作可行性小。淚液位于眼表，其收集是無(wú)創(chuàng)的，可將損傷、感染及其他風(fēng)險(xiǎn)降至最低，被檢者痛苦小，對(duì)操作者技術(shù)要求亦較小。淚液中含有多種蛋白，它們的變化與疾病的產(chǎn)生、發(fā)展密切相關(guān)，因此對(duì)于淚液蛋白質(zhì)組的研究有著深遠(yuǎn)的意義。目前大部分蛋白質(zhì)組的研究，是關(guān)于某種眼病或外傷、手術(shù)后相關(guān)組織的蛋白質(zhì)變化;在今后的研究中，要更側(cè)重于發(fā)現(xiàn)可以用于早期診斷的標(biāo)記蛋白，發(fā)現(xiàn)新的分子通路和藥物作用靶位點(diǎn)，為尋找新的早期診斷和治療手段提供全新的依據(jù)。

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