促進(jìn)真皮替代物血管化進(jìn)程的因素

周顯玉 綜述 楊軍 審校

Yannas于1980年首次提出真皮替代物的概念[1]。此后，諸多學(xué)者對真皮替代物的作用機(jī)制、設(shè)計(jì)原則及形式、應(yīng)用范圍等進(jìn)行了廣泛的研究[2-4]。同自體組織移植相比，真皮替代物在燒傷重建外科領(lǐng)域顯示了獨(dú)特的性能與廣闊的前景，但是存在創(chuàng)基血管延遲或難以長入真皮的缺陷。

1 真皮替代物的分類及性質(zhì)

商業(yè)化皮膚替代品可按其成分、應(yīng)用范圍、性質(zhì)等屬性進(jìn)行分類，其中真皮替代物主要包括Integra、Alloderm、Dermagraft、TransCyte 及 Permacol等[5-6]。

真皮替代物具備良好的細(xì)胞貼附性和生物相容性，可以利用其支架作用構(gòu)建皮膚、脂肪、軟骨、骨和角膜等[7-8]。真皮替代物修復(fù)皮膚缺損，技術(shù)簡單，對機(jī)體的創(chuàng)傷小，無毒性、抗原性小、易黏附、可降解、炎癥反應(yīng)小、可抵抗創(chuàng)面膠原酶的消化、創(chuàng)面覆蓋時(shí)便于應(yīng)用和控制，是良好的支架材料[9-10]。

2 真皮替代物的應(yīng)用現(xiàn)狀

上世紀(jì)末,隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和組織工程技術(shù)的發(fā)展，各種真皮替代物已廣泛應(yīng)用于燒傷、慢性潰瘍、鼻部重建和唇擴(kuò)大術(shù)中[11]。

真皮替代物修復(fù)組織缺損常分兩步進(jìn)行，初期以真皮替代物移植創(chuàng)面，待肉芽組織長入并完全取代需2～3周時(shí)間[12]；二期在真皮表面移植自體斷層皮片，如果初期創(chuàng)面閉合較理想，可提前進(jìn)行二期的自體皮片移植[12]。對于ADM（Acellular dermal matrix），近年來發(fā)現(xiàn)運(yùn)用一步法（移植脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的同時(shí)移植自體斷層皮片）臨床效果與兩步法無明顯差異，多數(shù)學(xué)者現(xiàn)傾向于一步法的治療[13]。

組織創(chuàng)傷及缺損的修復(fù)在未來仍將是一個(gè)重大的醫(yī)療問題，特別是慢性創(chuàng)傷，常常導(dǎo)致組織功能缺失[14-15]。各種皮膚替代品、細(xì)胞因子和合成的脫細(xì)胞基質(zhì)的應(yīng)用越來越受到關(guān)注，而真皮替代物移植后血管化的研究也開展地愈加頻繁。

3 促進(jìn)真皮替代物血管化的因素

3.1 單純真皮替代物移植

單純真皮替代物修復(fù)各種原因引起的皮膚缺損時(shí)，創(chuàng)基血管長入真皮替代物并建立血供的時(shí)間因真皮材質(zhì)、缺損部位及大小、缺損程度、受區(qū)血管大小等因素而異。一般移植后第3天即有血管化跡象，4周以后真皮替代物多能完全被肉芽組織取代，新生血管基本穩(wěn)定[16-20]。

真皮替代物真正建立局部血液循環(huán)至少需要10～15 d[16]，由于上皮組織需從上皮-真皮交界處的毛細(xì)血管持續(xù)獲取營養(yǎng)，這個(gè)時(shí)間明顯超過了上皮的缺血耐受時(shí)間（超過1周即可出現(xiàn)上皮的壞死、脫落）。因此，促進(jìn)毛細(xì)血管的生長及血供的建立是非常重要的。

Yao于1981年首次提出預(yù)構(gòu)皮瓣的概念[21]，Walton等于1987年首次將動(dòng)物體內(nèi)穩(wěn)定血管與生物活性材料在體內(nèi)構(gòu)建人工合成的帶蒂血管組織，再延遲與自體斷層皮片共同修復(fù)創(chuàng)面缺損[22-24]。此后，單純真皮替代物移植的研究日趨減少，以真皮替代物、細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞因子為基礎(chǔ)的復(fù)合實(shí)驗(yàn)研究逐漸興起。

3.2 成纖維細(xì)胞

真皮成纖維細(xì)胞在皮膚組織的再生中起關(guān)鍵作用，其在損傷部位早期出現(xiàn)并迅速增生，部分分化為肌成纖維細(xì)胞，通過調(diào)控Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原、彈力蛋白和層黏連蛋白等基質(zhì)的定位、表皮分化和真皮再生，來加速創(chuàng)傷愈合[25-28]。Kazutaka等在真皮替代物中加入體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，修復(fù)大鼠全厚皮片缺損，10 d后活檢顯示創(chuàng)面的毛細(xì)血管密度增加；成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血小板源性創(chuàng)傷愈合因子三者同時(shí)配合真皮替代物治療，第2天真皮替代物周圍即開始生長毛細(xì)血管，第5天即發(fā)現(xiàn)真皮層下毛細(xì)血管增多，約7～10 d血管開始長入真皮膠原[29]。

隨著以細(xì)胞為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展,成纖維細(xì)胞可使真皮替代物移植后過度表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子，促進(jìn)新血管的生成，進(jìn)而更好地與受區(qū)部位的血管網(wǎng)吻合[30-32]，縮短真皮替代物的血管化時(shí)間。

3.3 細(xì)胞因子

3.3.1 血管內(nèi)皮生長因子

血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是強(qiáng)有力的促血管生成因子，能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂和血管的發(fā)生，提高單層內(nèi)皮的通透性。根據(jù)mRNA不同的剪切方式，VEGF至少產(chǎn)生 5種不同的蛋白形式，其中 VEGF121、VEGF145、VEGF165是分泌型可溶性蛋白，直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其增殖。

生理狀態(tài)下VEGF的半衰期為30～45min，缺血條件下其生物活性可延長至6～8 h[30]。VEGF能夠促進(jìn)血管的再生、增強(qiáng)血流灌注，慢性缺氧模型實(shí)驗(yàn)中可顯著提高組織、皮瓣的活力[31-32]。大鼠管狀帶蒂皮瓣模型研究顯示，VEGF對斷蒂后皮瓣遠(yuǎn)端皮膚成活面積具有積極的影響，VEGF能夠促進(jìn)受區(qū)營養(yǎng)性血管的生長，加強(qiáng)受區(qū)與供區(qū)血管的新生與建立，縮短皮瓣轉(zhuǎn)移的時(shí)間[33]。大鼠腹直肌肌皮瓣（TRAM）缺血-VEGF局部應(yīng)用模型研究發(fā)現(xiàn)，VEGF能夠促進(jìn)皮瓣血管的再生，提高皮瓣的活力[34-35]。

VEGF表達(dá)于正在形成中的血管，其受體只表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，在缺血缺氧及血管破壞的情況下VEGF表達(dá)增加；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，VEGF還可以誘導(dǎo)生理性血管的生成，增加血管的滲透功能。目前，人源性重組VEGF已應(yīng)用于臨床和相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，其作用機(jī)理、應(yīng)用領(lǐng)域及范疇需進(jìn)一步地研究論證。

3.3.2 堿性成纖維細(xì)胞生長因子

堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）是目前已知的促血管生成作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子之一，也是間充質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)外胚層強(qiáng)有力的分裂原。它能夠影響細(xì)胞的分化和黏附，促進(jìn)細(xì)胞遷移，誘導(dǎo)胚胎發(fā)育過程中的中胚層形成[36-37]，刺激成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮管腔的形成，增加膠原酶和結(jié)締組織的合成，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移到膠原基質(zhì)中[38]，從而改變真皮替代物的塑形。

由于bFGF在組織內(nèi)半衰期短（自然半衰期為9 h，8 h后總量僅為原來的20%），利用緩釋物質(zhì)，如明膠微球包裹bFGF與真皮替代物配合治療，比單純局部使用bFGF效果更好[39]。

外膠原支架的培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，bFGF能夠加速毛細(xì)血管的形成，促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。小鼠耳微循環(huán)模型證實(shí)了bFGF在缺氧狀態(tài)下更能促進(jìn)毛細(xì)血管的生長和新血管的生成，并增加原血管的總長[40]。該結(jié)果對于真皮替代物移植有啟發(fā)性作用，絕大多數(shù)創(chuàng)面在植皮前面臨著不同程度的血供受損與缺氧，bFGF輔助治療將有助于真皮替代物快速建立血供，促進(jìn)創(chuàng)面的短期恢復(fù)。

利用bFGF在皮下預(yù)構(gòu)皮瓣，3 d內(nèi)血管蒂及皮膚周圍小血管即有新血管形成，第5天血管蒂與真皮下血管建立聯(lián)系，移植后1周掀起皮瓣，以bFGF處理，可明顯延長成活時(shí)間[41-42]。

bFGF聯(lián)合真皮替代物治療膠原病、糖尿病等引起的慢性創(chuàng)面，效果顯著。在臨床上，Masaki等聯(lián)合應(yīng)用真皮替代物和bFGF修復(fù)長期類固醇治療后結(jié)締組織頑固性潰瘍，創(chuàng)面均完全愈合，隨訪2年復(fù)發(fā)率為0[43]。

實(shí)驗(yàn)研究顯示，bFGF聯(lián)合其他生長因子如上皮生長因子（EGF）或血小板源生長因子（PDGF）等，治療效果有疊加作用。由于其半衰期短，如何延長其作用時(shí)間，例如進(jìn)行系統(tǒng)性管理或緩釋物質(zhì)包裹等，是一項(xiàng)技術(shù)難點(diǎn)。

3.3.3 轉(zhuǎn)化生長因子

轉(zhuǎn)化生長因子（β-TGF）是目前已知與瘢痕形成關(guān)系最密切、最具代表性的細(xì)胞因子，其通過與細(xì)胞表面相應(yīng)的受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖分化、胚胎發(fā)育、傷口愈合和血管的生成。通過實(shí)驗(yàn)皮下預(yù)置三維模型替代物如聚酯海綿、聚四氟乙烯（PTFE）[44]、聚乙烯醇泡沫板[45]和 Matrigel[46]（一種富含基膜組織的細(xì)胞外基質(zhì)）等，局部輔助應(yīng)用β-TGF因子，證實(shí)β-TGF是一種血管生成的強(qiáng)力誘導(dǎo)因子。Michael[47]在前人的研究基礎(chǔ)上，闡述了β-TGF的分類、作用機(jī)制、分子生物學(xué)效應(yīng)及對血管生成作用的影響，揭示血管生成是一個(gè)復(fù)雜的多分子通路調(diào)控、多細(xì)胞因子參與的過程，其中β-TGF對血管的生成發(fā)揮著極其重要的作用。而通過定量檢測β-TGF受體來間接反應(yīng)新生毛細(xì)血管的增生狀態(tài)，已是廣為認(rèn)可的一種有效手段。

3.3.4 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子

基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）持續(xù)表達(dá)于包括皮膚、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、骨髓內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的多種組織當(dāng)中，通過配體-受體方式與CXCR4作用，在白細(xì)胞、造血干細(xì)胞的遷移、歸巢及內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)活動(dòng)中發(fā)揮重要功能[48]。最近研究表明，在肉芽組織早期階段，SDF-1在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平同時(shí)下調(diào)，創(chuàng)面分泌的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1（IL-1）、干擾素-γ（INF-γ）等細(xì)胞因子均可降低成纖維細(xì)胞中SDF-1的表達(dá)。

大鼠實(shí)驗(yàn)研究SDF-1對真皮替代物Tegaderm覆蓋全厚皮片缺損的作用效果。術(shù)后18 d檢測結(jié)果顯示，SDF-1能夠促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和瘢痕的愈合，減少傷面收縮[49]。裸鼠實(shí)驗(yàn)研究內(nèi)皮祖細(xì)胞介導(dǎo)SDF-1對血管形成的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，SDF-1能夠增加缺氧組織的血流灌注和毛細(xì)血管密度[50]。利用生物性可降解材料殼聚糖或PGA作為緩釋物質(zhì)包裹SDF-1作用于動(dòng)物模型創(chuàng)面，SDF-1作為趨化因子能夠觸發(fā)間質(zhì)干細(xì)胞的歸巢和遷移，后者既可分化為包括成纖維細(xì)胞在內(nèi)的多種皮膚細(xì)胞，還可以通過影響CD34+分子的增殖和遷移，來誘導(dǎo)體內(nèi)血管的形成，創(chuàng)面缺損修復(fù)效果明顯[51]。

內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）持續(xù)表達(dá)SDF-1的受體CXCR4，SDF-1主要通過介導(dǎo)EPCs的遷移、聚集，促進(jìn)損傷部位血管的再生。目前，大部分的實(shí)驗(yàn)研究主要集中在SDF-1促進(jìn)祖細(xì)胞、干細(xì)胞的遷移、歸巢方面，SDF-1因子與真皮替代物聯(lián)合治療對各種原因引起的皮膚慢性創(chuàng)傷、皮膚缺損、骨外露等的治療具有重要意義。

3.4 生物載體介導(dǎo)細(xì)胞因子的基因治療

減活腺病毒或質(zhì)粒介導(dǎo)VEGF、β-TGF或PDGF等細(xì)胞因子的研究顯示了生物載體介導(dǎo)細(xì)胞因子的基因治療具有廣闊的前景。

表達(dá)VEGF或β-TGF的E1/E3減活腺病毒協(xié)同真皮替代物修復(fù)創(chuàng)面缺損，4周后組織學(xué)、微血管造影等觀察發(fā)現(xiàn)，皮瓣組織局部血流灌注顯著提高，血管分布面積明顯增大，皮瓣遠(yuǎn)端皮膚的壞死面積明顯降低[52-53]；表達(dá)PDGF或VEGF的質(zhì)粒修復(fù)動(dòng)物模型全厚缺損創(chuàng)面，皮片表面光滑有彈性，抗磨擦性強(qiáng)，毛細(xì)血管分布多且均勻，新形成血管的數(shù)量增加，真皮層形成速度加快；RT-PCR及蛋白印跡發(fā)現(xiàn)無論是在mRNA還是蛋白質(zhì)水平上，與血管生成相關(guān)的因子VEGF、CD31+及平滑肌肌動(dòng)蛋白（a-SMA）的表達(dá)均顯著升高[54]。

細(xì)胞因子局部應(yīng)用時(shí)，存在組織原位持續(xù)作用時(shí)間短的缺點(diǎn)，生物載體介導(dǎo)細(xì)胞因子的基因治療方法不僅可以克服細(xì)胞因子初始治療的高劑量用藥問題，同時(shí)也避免了因半衰期短致使每日重復(fù)給藥的刺激，是基因工程技術(shù)的一大進(jìn)展，通過局部持續(xù)、過量表達(dá)相應(yīng)的細(xì)胞因子，加強(qiáng)了局部的血流灌注和血管生成，加速了皮瓣的成活及成熟，是一項(xiàng)值得期待、推廣的基因工程技術(shù)。

3.5 干細(xì)胞治療

脂肪干細(xì)胞（ASCs）和骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）具有多項(xiàng)分化潛能，不同微環(huán)境下能夠分化為脂肪、骨、軟骨、肌腱等多種細(xì)胞，在體外穩(wěn)定增殖且衰亡率低，具有來源廣泛、取材容易、體內(nèi)儲備量大、少量組織即可獲得大量干細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為近年來新的研究熱點(diǎn)之一。許多學(xué)者已經(jīng)開始利用干細(xì)胞治療糖尿病、周圍動(dòng)脈炎、結(jié)締組織疾病及腫瘤術(shù)后放療等原因引起的皮膚難治性潰瘍，取得了良好的療效。

絲裂霉素C建立的大鼠難治療潰瘍模型中，用ASCs協(xié)同真皮替代物修復(fù)創(chuàng)面，1～2周后發(fā)現(xiàn)ASCs能夠促進(jìn)肉芽組織、毛細(xì)血管和上皮化的形成，加速創(chuàng)傷的愈合[55-57]；鏈脲霉素構(gòu)建的小鼠糖尿病模型中，MSCs與真皮替代物共同修復(fù)全厚缺損，7 d后創(chuàng)傷面積顯著減小，血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31+表達(dá)明顯增加[58-59]；而膠原基質(zhì)與MSCs聯(lián)合修復(fù)小鼠皮膚缺損微循環(huán)模型中，術(shù)后第3、5、7天觀察發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用MSCs治療的皮膚毛細(xì)血管密度顯著高于對照組，臨床上運(yùn)用這種方法已成功治愈1例傳統(tǒng)方法治療1年仍未愈合的創(chuàng)面[60]，充分展示了干細(xì)胞治療的廣闊前景。

Anne等總結(jié)關(guān)于MSCs治療創(chuàng)傷愈合的研究成果，列舉每篇成果的動(dòng)物模型、MSCs應(yīng)用方法、機(jī)制和結(jié)局，提示MSCs能夠通過促進(jìn)上皮化、肉芽組織的形成和血管生成，加速創(chuàng)面的愈合[61]。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的真皮層成纖維細(xì)胞不僅與正常的成纖維細(xì)胞相近，而且微環(huán)境產(chǎn)生的細(xì)胞因子還能調(diào)控膠原的沉著，真皮層在形態(tài)上更接近正常[62]。

干細(xì)胞的多向分化潛能及調(diào)控機(jī)制是再生醫(yī)學(xué)的一個(gè)重要課題，而將其合理地應(yīng)用到整復(fù)外科的實(shí)踐當(dāng)中去，將具有傳統(tǒng)治療方法無可比擬的優(yōu)勢。

3.6 真皮替代物孔徑大小對血管密度的影響

上世紀(jì)80年代，Yannas等就對真皮替代物基質(zhì)孔徑大小影響其血管化的問題進(jìn)行了相關(guān)研究；Andrej在2005年利用PEGT/PBT材料作為真皮基質(zhì)替代物移植到大鼠身上，研究其不同孔徑在不同時(shí)間段對新血管生成的影響，結(jié)果顯示，孔徑較大的真皮移植后第7天，在移植部位即有新生血管生成，并且在3個(gè)不同的時(shí)間段血管化程度均大于孔徑較小的[63]。

真皮替代物孔徑直徑過小會(huì)阻礙細(xì)胞、血管、細(xì)胞因子等的滲透，過大則達(dá)不到覆蓋的目的，失去了細(xì)胞、血管支架的作用。一定范圍孔徑大小的真皮替代物有利于創(chuàng)面基部血管的長入，進(jìn)而加速血管化的進(jìn)程。

3.7 促進(jìn)真皮替代物血管化的其他因素

除以上因素，細(xì)胞因子中血小板源生長因子（PDGF）能夠刺激停滯于G0/G1期的成纖維細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞進(jìn)入分裂增殖周期，在組織和細(xì)胞的生長分化、免疫反應(yīng)及創(chuàng)傷愈合等方面發(fā)揮重要作用。對移植后的真皮替代物進(jìn)行高壓氧刺激和脈沖光間斷照射[53]，也能促進(jìn)血管的形成。另創(chuàng)面既存知名血管的營養(yǎng)血管在缺氧缺血情況下更易生發(fā)出新的血管，加速真皮替代物的血管化進(jìn)程。真皮替代物在血運(yùn)豐富的部位如頭皮、顏面部等，亦較其他血運(yùn)相對差的部位更易建立血供。

4 展望

真皮替代物在燒傷重建外科領(lǐng)域發(fā)揮了巨大的作用，但其發(fā)展運(yùn)用到現(xiàn)在，尚不能夠完全取代正常的皮膚組織。與自體皮片移植相比，真皮替代物的血管化進(jìn)程仍明顯偏慢；而在臨床上，由于病人體質(zhì)、病情狀況、醫(yī)院制度等因素的影響，血管化時(shí)間往往還要長于實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果。組織修復(fù)是一種多細(xì)胞、多因子、多水平調(diào)控的過程，組織器官如果缺乏正常的血供，會(huì)產(chǎn)生一系列病理性改變，包括水腫、循環(huán)障礙、感染，甚至局部壞死。真皮替代物作為異體物質(zhì)修復(fù)組織缺損更是不得不面對這一難題，弄清組織修復(fù)的機(jī)理，調(diào)控組織修復(fù)的過程，同時(shí)形成成熟的監(jiān)控監(jiān)測技術(shù)，是促進(jìn)真皮替代物在整復(fù)外科領(lǐng)域中更好發(fā)展的成功保障。

基因微矩陣、蛋白質(zhì)組學(xué)與非病毒性基因嵌合、干細(xì)胞移植等技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，是未來更好地研發(fā)血管化真皮替代物的方向；而如何有效地將組織再生過程中參與炎癥反應(yīng)、組織生成的細(xì)胞及細(xì)胞因子加以調(diào)控管理，促進(jìn)血管的再生及血運(yùn)的重建，是當(dāng)今再生醫(yī)學(xué)和整復(fù)外科領(lǐng)域?qū)W者們必須要面對的一大挑戰(zhàn)。

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