復(fù)合染料在嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)中的應(yīng)用

李云 郭書俠 董蕤

嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)臨床常見的是直接計(jì)數(shù)、涂片白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)和血球計(jì)數(shù)儀分類計(jì)數(shù)3種方法。但是臨床上為了解疾病進(jìn)展過程，需要動態(tài)觀察嗜酸性粒細(xì)胞的變化，往往采用嗜酸性粒細(xì)胞直接計(jì)數(shù)。目前嗜酸性粒細(xì)胞直接計(jì)數(shù)方法很多，全國臨床檢驗(yàn)專業(yè)委員會推薦的Hinkemann液［1］為經(jīng)典嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)稀釋液，它與報(bào)道的稀釋液相比，各有優(yōu)缺點(diǎn)。筆者曾報(bào)道過2種嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)稀釋液。文獻(xiàn)報(bào)道的嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)稀釋液都用的是單個(gè)染料，為此我們在工作中，根據(jù)染料的特點(diǎn)，嘗試用復(fù)合染料配制稀釋液，其目的是探索一種具有細(xì)胞染色與背景相差大，便于觀察，減少誤差，提高工作效率，為臨床提供及時(shí)、準(zhǔn)確的結(jié)果。我們運(yùn)用溴甲酚綠和甲基紅配制稀釋液作嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)稀釋液，在臨床實(shí)踐2年，計(jì)數(shù)結(jié)果比較準(zhǔn)確，令人滿意，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑 Hinkemann液:按《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》［1］配制。復(fù)合染料計(jì)數(shù)稀釋液:稱取溴甲酚綠18 mg、甲基紅12 mg溶于50 ml 0.9%氯化鈉溶液中，再加入0.6 ml TritonX-100，加0.9%氯化鈉溶液至100 ml。

1.2 方法 嗜酸性粒細(xì)胞直接計(jì)數(shù):在試管中加入稀釋液0.38 ml，取患者末梢血(或 EDTA.2K 抗凝全血)0.02 ml，混勻，5 min后沖入計(jì)數(shù)池，靜置3～5 min，用低倍鏡計(jì)數(shù)，鏡下嗜酸性粒細(xì)胞被染成綠色，其他未被破壞的細(xì)胞幾乎不著色。計(jì)數(shù)兩計(jì)數(shù)室10個(gè)大方格內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)。計(jì)算:嗜酸性粒細(xì)胞/L=10個(gè)大方格內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)×20×106。

2 結(jié)果

2.1 對比試驗(yàn) 我院取門診和住院109例患者的EDTA.2NA抗凝全血，分別用Hinkemann液(Y)與復(fù)合染料稀釋液(X)進(jìn)行嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，2種稀釋液計(jì)數(shù)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表1。其相關(guān)系數(shù)0.993，相關(guān)方程 Y=0.858 X+6.2。

表1 109例復(fù)合染料稀釋液與Hinkemann液計(jì)數(shù)值比較×106，±s

表1 109例復(fù)合染料稀釋液與Hinkemann液計(jì)數(shù)值比較×106，±s

復(fù)合染料稀釋液 Hinkemann液232±136 229±128

2.2 鏡下比較 Hinkemann液背景顏色為紅色，嗜酸性粒細(xì)胞被染成桔紅色;復(fù)合染料稀釋液為酒紅色，加入抗凝全血后變紫色，嗜酸性粒細(xì)胞被染成綠色，它與背景顏色反差大，它比Hinkemann液將嗜酸性粒細(xì)胞被染成桔紅色更有利于辨認(rèn)。

2.3 著色時(shí)間比較 將稀釋液與抗凝全血混合后，分別在60 s、120 s 、180 s 、240 s、270 s、300 s進(jìn)行直接計(jì)數(shù)，Hinkemann液在270 s后嗜酸性粒細(xì)胞被染成桔紅色，復(fù)合染料稀釋液在120 s后嗜酸性粒細(xì)胞被染成綠色。

2.4 著色穩(wěn)定時(shí)間比較 將109例計(jì)數(shù)完的標(biāo)本分別在1 h、4 h、8 h再進(jìn)行直接計(jì)數(shù)(表2)，Hinkemann液在1 h時(shí)計(jì)數(shù)與5 min時(shí)計(jì)數(shù)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。到4 h時(shí)計(jì)數(shù)結(jié)果更低，計(jì)數(shù)無意義。而復(fù)合染料稀釋液在1 h、4 h時(shí)計(jì)數(shù)與Hinkemann液5 min時(shí)計(jì)數(shù)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，在8 h時(shí)計(jì)數(shù)與Hinkemann液5 min時(shí)計(jì)數(shù)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明復(fù)合染料稀釋液與全血作用后4 h后仍可以計(jì)數(shù)報(bào)告。

表2 109例復(fù)合染料稀釋液與Hinkemann液在不同時(shí)段計(jì)數(shù)值比較106×xˉ±s

2.5 試劑保質(zhì)期比較 Hinkemann液使用1個(gè)月后，嗜酸性粒細(xì)胞著色淺或整個(gè)嗜酸性粒細(xì)胞不完全著色，需重新配制。復(fù)合染料稀釋液使用1年后，嗜酸性粒細(xì)胞著色仍然與新配制的一樣。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 用復(fù)合染料稀釋液進(jìn)行嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)25次重復(fù)試驗(yàn)，±S=(254±61)×106，CV=2.4%。

3 討論

目前，報(bào)道嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)稀釋液使用的染料有很多種，如:伊紅、溴甲酚紫、溴甲酚綠、溴酚藍(lán)［2］等。這些都是單個(gè)染料，我們嘗試運(yùn)用復(fù)合染料溴甲酚綠和甲基紅，利用它的細(xì)胞著色與背景反差較大，它的變色pH值5.1，顏色由酒紅色變綠色，嗜酸性粒細(xì)胞被染成綠色，背景為紫色，這樣的顏色比較直觀，一看就一目了然。溴甲酚綠和甲基紅按3∶2比例配制，我們分別取溴甲酚綠45 mg/L和甲基紅30 mg/L、溴甲酚綠90 mg/L和甲基紅60 mg/L、溴甲酚綠180 mg/L和甲基紅120 mg/L、溴甲酚綠300 mg/L和甲基紅200 mg/L四種濃度的進(jìn)行配制，發(fā)現(xiàn)濃度大于溴甲酚綠180 mg/L和甲基紅120 mg/L，背景綠色太深，不便于對嗜酸性粒細(xì)胞觀察;濃度小于溴甲酚綠180 mg/L和甲基紅120 mg/L，背景綠色很適合，便于對嗜酸性粒細(xì)胞辨認(rèn)，但染色時(shí)間要延長。為了克服上述缺點(diǎn)，我們采用溴甲酚綠180 mg/L和甲基紅120 mg/L的濃度，不但嗜酸性粒細(xì)胞容易辨認(rèn)，染色時(shí)間也較短。由于我們使用了表面活性劑TritonX-100，它能加速染料溶解;增強(qiáng)染料對細(xì)胞的滲透作用，從而使細(xì)胞著色加快。TritonX-100的濃度為0.6%［3］時(shí)，只破壞除嗜酸性粒細(xì)胞以外的細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞幾乎不受影響。本稀釋液是等滲的，有利于嗜酸性粒細(xì)胞不被破壞，因而能長時(shí)間保留著色的樣本。本稀釋液沒使用揮發(fā)性試劑，這樣稀釋液保質(zhì)期就相對較長，使用1年之久，仍效果很好?？傊痉ň哂屑?xì)胞著色與背景反差大，便于辨認(rèn)，著色時(shí)間短，著色穩(wěn)定時(shí)間長，試劑保質(zhì)期長等優(yōu)點(diǎn)。易于推廣。

1 葉應(yīng)嫵，王毓三，申子瑜主編.全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程.第3版.南京:東南大學(xué)出版社，2006.136.

2 李云，郭書俠.溴酚藍(lán)在嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)中的應(yīng)用.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，22:34.

3 幸建英，尹玲，王學(xué)風(fēng).TritonX-100在嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)中的應(yīng)用.陜西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，1996，11:50.