Survivin基因啟動(dòng)子區(qū)-31C＞G功能性多態(tài)與卵巢癌遺傳易感性的關(guān)聯(lián)研究

靳麗娟 霍京麗 張素花

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，因其起病隱匿，惡性程度高，多數(shù)患者就診時(shí)已是晚期，盡管近年來手術(shù)、化學(xué)藥物治療和放射治療技術(shù)不斷改進(jìn)，5年生存率仍無明顯提高。因此，研究卵巢癌的發(fā)病機(jī)制、尋找新的診斷和治療靶點(diǎn)，已經(jīng)成為提高其預(yù)防和治療效果的當(dāng)務(wù)之急。Survivin基因位于人類染色體17q25，是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成員，具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的雙重功能［1］。已有研究證實(shí)，Survivin蛋白在卵巢上皮性癌組織中呈異常高表達(dá)，與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［2－4］。存在于Survivin基因上的多態(tài)位點(diǎn)可能影響survivin基因的轉(zhuǎn)錄活性和表達(dá)水平。例如，位于survivin基因啟動(dòng)子區(qū)的-31C＞G多態(tài)可通過改變CDE/CHR調(diào)控元件結(jié)合位點(diǎn)的特異序列，增加阻遏蛋白與CDE/CHR元件結(jié)合，進(jìn)而影響腫瘤的遺傳易感性［5，6］。已有報(bào)道顯示-31C＞G多態(tài)與肺癌［5］、腎癌［7］、膀胱癌［8］、胃癌［9］、食管癌［10］、結(jié)腸癌［11］等多種惡性腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，但未見與卵巢癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的病例對(duì)照研究。本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-連接酶檢測(cè)反應(yīng)(polymerase chain reaction-ligase detection reac-tion，PCRLDR)技術(shù)，通過基于醫(yī)院的病例-對(duì)照研究，探討中國(guó)北方漢族人群survivin基因啟動(dòng)子區(qū)-31C＞G多態(tài)與卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer，EOC)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 138例卵巢上皮性癌患者(病例組)為2006年至2011年在筆者所在醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的北方漢族女性，術(shù)前未行放射或化學(xué)治療，術(shù)后標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，其中漿液性癌52例，黏液性癌17例，宮內(nèi)膜樣癌50例和低分化腺癌19例;臨床分期采用國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)標(biāo)準(zhǔn)(2000年)，其中早期(Ⅰ～Ⅱ期)卵巢癌47例，晚期(Ⅲ～Ⅳ期)卵巢癌91例;確診時(shí)年齡＜50歲患者49例，≥50歲患者89例。另選擇同一地區(qū)138例健康婦女作為對(duì)照組，對(duì)照組女性均無腫瘤和遺傳病史。所有研究對(duì)象均有知情同意。

1.2 DNA提取 抽取患者及對(duì)照個(gè)體靜脈血5 ml，以枸櫞酸鈉抗凝，采用Miller等［12］的蛋白酶K－氯化鈉鹽析法提取白細(xì)胞DNA。

1.3 基因多態(tài)性檢測(cè) 采用PCR-LDR方法進(jìn)行基因型檢測(cè)。擴(kuò)增-31C＞G SNP位點(diǎn)的上、下游引物序列分別為5’-CGCCTCTACTCCCAGAAGGC-3’和 5’-GAGATGCGGTGGTCCTTGAGAA-3’，擴(kuò)增片段為187 bp。PCR 反應(yīng)體系為 15 μl，其中模板 DNA 1 μl，10 × PCR 緩沖液和 MgCl2各 1.5 μl，Taq-DNA聚合酶 0.2 μl，dNTPs(10 mmol/L)0.3 μl，DMSO 0.2 μl，上、下游引物各0.25 μl。PCR反應(yīng)條件為:94℃ 2 min預(yù)變性后，94℃變性15 s、60℃退火15 s、72℃延伸25 s，35 個(gè)循環(huán)后，72℃繼續(xù)延伸3 min。根據(jù)LDR探針設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)LDR的熒光探針，特異性探針1(針對(duì)C堿基)為5’-CATTAACCGCCAGATTTGAATCGCC-3’;特異性探針2(針對(duì)G堿基)為5’-TTTCATTAACCGCCAGATTTGAATCGCG-3’。通用探針為的 5’-P-GGACCCGTTGGCAGAGGTGGCGGCG-FAM-3’。LDR反應(yīng)體系:1×Buffer緩沖液 1 μl，探針混合液 0.03 μl，連接酶 0.125 μl，PCR產(chǎn)物2 μl，PCR 專用水補(bǔ)齊至10 μl。反應(yīng)條件:95℃ 30 s，56℃2 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。基因分型如圖1所示。

圖1 Survivin基因-31C＞G多態(tài)分型(PCR-LDR法)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)(df=1)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡分析2組的基因型頻率及等位基因型分布比較采用χ2檢驗(yàn)，應(yīng)用非條件Logistic回歸模型計(jì)算OR值和95%CI，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的一般特征 病例組年齡19～64歲，中位年齡51歲;對(duì)照組年齡22～62歲，中位年齡49歲;2組年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。對(duì)照survivin基因-31C＞G多態(tài)的基因型分布均符合 Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.44，P=0.51)。

2.2 Survivin基因-31C＞G多態(tài)與卵巢癌的關(guān)系 Survivin基因-31C＞G多態(tài)三種基因型(GG、CG、CC)頻率在病例組中分別為 17.4%、46.4% 和 36.2%，與對(duì)照組(28.3%、47.1% 和24.6%)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.627，P=0.036);病例組C等位基因頻率(59.4%)顯著高于對(duì)照組(48.2%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.004，P=0.008)。見表1。

表1 Survivin基因-31C＞G多態(tài)的基因型及等位基因型頻率分布n=276，例(%)

2.3 Survivin基因-31C＞G多態(tài)與卵巢上皮性癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián) 與GG基因型相比，CC基因型能增加EOC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR 值為2.39，95%CI為 1.22-4.67);與 G 等位基因相比，C等位基因亦能增加EOC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR值為1.57，95%CI為1.12～2.21);同時(shí)進(jìn)行基因的顯性模型和隱性模型分析發(fā)現(xiàn)，C等位基因無論作為隱性基因還是顯性基因均能增加EOC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。見表2。

表2 Survivin基因-31C＞G多態(tài)與卵巢上皮性癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)n=276，例

3 討論

卵巢癌是病死率最高的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速，70% ～80%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期［1］。但迄今為止，卵巢癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。研究顯示遺傳易感性可能在其發(fā)生中起重要作用。Survivin基因作為一個(gè)重要的遺傳候選基因，由于具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的雙重功能，近年來成為研究的熱點(diǎn)。

腫瘤是一個(gè)多基因參與的與細(xì)胞周期紊亂和凋亡受阻密切相關(guān)的疾病。Survivin基因位于人類染色體17q25，基因全長(zhǎng)為14.7 kb，由3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子組成，是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成員，廣泛表達(dá)于人類胚胎組織和惡性腫瘤組織中，但不表達(dá)于正常組織和終末分化的成人組織。大量的研究證實(shí)，Survivin蛋白的高表達(dá)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用［2－4］。

存在于Survivin基因上的SNP位點(diǎn)可能影響基因的轉(zhuǎn)錄活性和表達(dá)水平，從而影響腫瘤的發(fā)生。-31C＞G多態(tài)位于啟動(dòng)子區(qū)細(xì)胞周期依賴性元件(cell cycle dependent element，CDE)/細(xì)胞周期同源區(qū)(cell cycle homology region，CHR)，-31G變異等位基因通過改變CDE/CHR調(diào)控元件結(jié)合位點(diǎn)的特異序列增加阻遏蛋白與CDE/CHR元件結(jié)合，從而降低survivin的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤遺傳易感性［5－6］。

國(guó)內(nèi)外有關(guān)Survivin基因與腫瘤關(guān)系的研究多集中在mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)水平上。例如，夏爽等［2］的研究顯示Survivin基因表達(dá)與卵巢上皮性癌的病理類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。高慶等［3］的研究顯示Survivin蛋白在卵巢癌組織中的表達(dá)顯著高于良性上皮性卵巢腫瘤組織和正常卵巢組織，且與病理分期、細(xì)胞分化程度有關(guān)(Survivin蛋白在Ⅲ～Ⅳ期惡性上皮性卵巢腫瘤組中的陽性表達(dá)高于Ⅰ～Ⅱ期腫瘤組織，在低分化惡性上皮性卵巢腫瘤組織中的陽性表達(dá)高于中、高分化腫瘤組)。馬志松等［4］的研究也顯示Survivin表達(dá)和癌細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。但關(guān)于Survivin基因啟動(dòng)子區(qū)-31C＞G功能性多態(tài)位點(diǎn)與腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道還很少，共查到相關(guān)文獻(xiàn)20余篇，多為和胃癌、結(jié)直腸癌等消化道腫瘤的相關(guān)報(bào)道，未見與卵巢癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的病例-對(duì)照研究。其中Han等［13］進(jìn)行了該位點(diǎn)和卵巢癌發(fā)病年齡的研究，發(fā)現(xiàn)攜帶CC基因型的患者發(fā)病年齡平均為57.1歲，較GG基因型攜帶者發(fā)病年齡提前(62.8歲)。

本研究結(jié)果提示survivin基因-31C＞G功能性多態(tài)可能與中國(guó)北方漢族女性EOC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，這與程正江等［14］和黃俊等［15］對(duì)胃癌和結(jié)直腸癌的研究結(jié)果相似。這就從蛋白水平、轉(zhuǎn)錄水平和基因水平同時(shí)驗(yàn)證了該多態(tài)與卵巢癌的關(guān)系:－31C等位基因影響CDE/CHR調(diào)控元件結(jié)合位點(diǎn)的特異序列，減少阻遏蛋白與CDE/CHR元件結(jié)合，從而上調(diào)survivin蛋白表達(dá)，進(jìn)而在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

總之，本研究結(jié)果顯示，survivin基因-31C＞G多態(tài)與卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，提示該功能性位點(diǎn)可能是卵巢上皮性癌的一個(gè)有意義的分子標(biāo)志物。

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