自體骨髓在兔腰椎橫突間融合中誘導(dǎo)成骨的組織學(xué)評估

蘇旻罡 劉志國 夏鐵成 郝建學(xué) 張建鵬

脊柱融合術(shù)是脊柱外科的基本手術(shù)之一，后外側(cè)橫突間、小關(guān)節(jié)突間融合是目前常用的方法，但假關(guān)節(jié)發(fā)生率較高，據(jù)報道為20% ～50%［1］。自體骨髓內(nèi)含有骨髓基質(zhì)干細胞，具有成骨能力。本實驗通過研究自體骨髓在腰椎橫突間融合中誘導(dǎo)成骨的作用，探討其作為骨移植添加物的效果，為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組與手術(shù) 健康、骨骼成熟中國白兔24只(由河北大學(xué)附屬醫(yī)院實驗中心提供，清潔級動物，普通環(huán)境、單籠喂養(yǎng)，飼喂質(zhì)量合格的全價飼料)，雌雄不限，體重3～3.5 kg，隨機分為實驗組(14只)和對照組(10只)。腹腔內(nèi)注射硫賁妥鈉(30 mg/kg)，如麻醉效果差，加用0.5%普魯卡因局部浸潤。腰5、6棘突為中心做后正中切口，自椎旁肌外側(cè)向前分離肌肉，顯露雙側(cè)5、6腰椎橫突，去除后方骨皮質(zhì)，取一側(cè)髂骨約1 g修剪成約0.3 cm3骨塊，每側(cè)橫突間植入約0.5 g。實驗組從另一側(cè)髂骨一點穿刺抽取2 ml骨髓，抽吸前注射器內(nèi)取0.1 ml肝素鈉液，2 ml與髂骨塊充分混勻放置數(shù)分鐘，每側(cè)融合區(qū)各植入0.5 g自體髂骨和1 ml自體骨髓的混合物。術(shù)后單籠喂養(yǎng)，未用外固定。術(shù)后4周每組各處死2只動物，8、12周，實驗組和對照組每批分別處死6、4只動物。脊柱標(biāo)本立即放入4℃、10%甲醛固定3～4 d。

1.2 觀察指標(biāo) 組織學(xué)觀察:將所有4、8、12周標(biāo)本制成組織切片，再經(jīng)過HE染色后觀察各時期融合骨塊生長情況，具體步驟:將固定好的標(biāo)本去除附帶的肌肉組織，放入8%甲酸液中脫鈣，直至針刺椎體見其變軟。取出標(biāo)本，清水沖洗干凈，將融合區(qū)切下，切成3×2×0.4 cm3小塊。將標(biāo)本編號后放入脫水盒中，室溫下經(jīng)不同濃度乙醇各脫水、氯仿透明、浸蠟包埋、切片。然后經(jīng)過烤片、脫蠟。最后經(jīng)HE染色、組織學(xué)觀察分析。

2 結(jié)果

2.1 實驗組 4周時見大量新生骨小梁，內(nèi)有較成熟骨髓組織(圖1)。8周時成熟骨小梁明顯增多，成骨細胞能力明顯降低。成熟骨小梁表面破骨細胞數(shù)量多，進入塑形改造階段(圖2)。12周時，新生骨小梁罕見，可見大量板層骨，表面的成骨細胞明顯減少，可見成熟骨髓組織，表面塑形改造已經(jīng)完成(圖3)。

2.2 對照組 新生骨小梁少，發(fā)育相對滯后。移植骨被纖維組織和破骨細胞包圍，表明移植骨被吸收(圖4)。8周時新生、成熟骨小梁均可見到，新生骨小梁較多，成骨細胞能力弱，成熟骨小梁明顯少于同時期的實驗組(圖5)。12周時，成熟骨小梁數(shù)量明顯少于實驗組。成骨細胞數(shù)目較8周時明顯減少，成骨能力明顯減弱(圖6)。

2.3 2組比較 各時期實驗組成骨方式始終以膜內(nèi)成骨為主，軟骨成骨為輔，對照組則相反。

圖1 實驗組4周標(biāo)本切片可見:大量新生骨小梁(粉染)，內(nèi)有大量骨細胞(紫染)，可見骨髓組織(HE×100)

圖2 實驗組8周標(biāo)本切片可見:成熟骨小梁明顯增多(粉染)，成骨細胞的能力明顯降低，可見較多的破骨細胞(紫染)，表明新生骨已經(jīng)進入塑形改造階段，可見成熟的骨髓組織(HE×100)

圖3 實驗組12周標(biāo)本切片可見:新生骨小梁罕見，可見大量板層骨，表面的成骨細胞明顯減少，內(nèi)有成熟骨髓組織，新生骨塑形改造已經(jīng)完成(HE×400)

3 討論

圖4 對照組4周標(biāo)本切片可見新生骨小梁少，發(fā)育相對滯后，移植骨被纖維組織和破骨細胞包圍，表明移植骨被吸收(HE×100)

圖5 對照組8周標(biāo)本切片可見:新生、較成熟骨小梁均存在，新生骨小梁較多，成骨細胞能力弱，成熟骨小梁明顯少于同時期的實驗組(HE×100)

圖6 對照組12周標(biāo)本切片可見:成熟骨小梁數(shù)量明顯少于實驗組(HE×400)

自體髂骨是較理想的骨移植物，具有成骨所需要的骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)作用，但其來源有限，特別對于假關(guān)節(jié)形成需二次手術(shù)、需多節(jié)段融合及小兒脊柱側(cè)彎矯形的患者。而且，取骨區(qū)并發(fā)癥較多，發(fā)生率6%～25%。目前，有多種骨移植材料用于脊柱融合，然而其費用昂貴并可能形成異位骨化，而且某些臨床實驗性應(yīng)用顯示其效果等同于自體髂骨移植。近些年，同種異體骨融合效果日益提高［1］，但仍然存在交叉感染疾病、免疫排斥反應(yīng)的風(fēng)險。而且，Butterman等［2］發(fā)現(xiàn)，胸腰椎后路融合應(yīng)該使用自體髂骨移植。目前研究較多的骨髓基質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)擴增后，復(fù)合載體用于脊柱融合，成骨作用強，融合率高［2］。但目前僅限于實驗研究，而且對技術(shù)設(shè)備要求高，只能手術(shù)植入，不能經(jīng)皮注射。

自體骨髓內(nèi)的紅骨髓含有造血細胞和骨髓基質(zhì)，骨髓基質(zhì)中含多能干細胞，Owen［3］稱之為骨髓基質(zhì)干細胞，其可以在無誘導(dǎo)下骨化，稱為確定性骨源性前體細胞(determined osteogenic precursor cells，DOPC)，也稱為骨源性干細胞(osteogenic stem cells)。Turksen等［4］證明，DOPC體外培養(yǎng)逐步分化成骨源性干細胞→骨祖細胞→前成骨細胞→成骨細胞→骨細胞。

目前，國內(nèi)外許多學(xué)者報道了臨床應(yīng)用自體骨髓移植治療骨折延遲愈合、不愈合、骨缺損和骨囊腫，涉及到脛骨、股骨、肱骨、手舟骨等，效果較好［5－8］。

本實驗組織學(xué)評估可見，各個時期中實驗組骨小梁數(shù)量、成熟度、形成時間均明顯優(yōu)于對照組。因此本實驗組可以證實，自體骨髓在兔腰椎橫突間融合模型中，是一種有效可靠的骨移植添加物，可以減少自體髂骨的用量，但融合效果優(yōu)于單純應(yīng)用自體髂骨移植。主要表現(xiàn)為融合時間較短、成骨量較多、融合牢固。自體骨髓來源充足，獲取方便，而且可以反復(fù)獲取，治療費用低，無傳染疾病、免疫排斥反應(yīng)的風(fēng)險，供骨區(qū)并發(fā)癥較少。是有效、安全、經(jīng)濟的移植添加物。

1 Friedlander GE，Clayton RP，Cole DJ，et al.Osteogenic Protein-1(BMP-7)in the treatment of tibial nonunions.JBJS(Am)，2001，83:151-158.

2 Butterman GR，Glazer PA，Bradford DS.The use of bone allografts in the spine.Clin Orthop，1996，324:75.

3 Owen ME.Lineage of osteogenic cells and their relationship to the stromal system.In:Peck WA，eds.Bone and Mineral Research.Amsterdam:Elsevier，1984.1-25.

4 Turksen K，Aubin JE.Positive and negative immunoselection for enrichment of tow classes of osteoprogenitor cells.J Cell Biol，1991，114:373-384.

5 梁雨田，張伯勛，盧世壁.經(jīng)皮自體骨髓移植在骨缺損瘢痕組織內(nèi)成骨作用的實驗研究與臨床應(yīng)用.中國修復(fù)重建外科雜志，1999，13:148-151.

6 王恒冰，王繼孟，郭宗遠.自體骨髓移植治療小兒孤立性骨囊腫的初步觀察.中華小兒外科雜志，2002，23:68.

7 徐耀增，王曉東，董天華.自體骨髓經(jīng)皮注射治療骨延遲愈合和骨不連.中國矯形外科雜志，2003，11:584-586.

8 Connolly JF，Guse R，Tiedeman J，et al.Autologous marrow injection as a substitute for operative grafting of tibal nonunious.Clin Orthop，1991，266:259-270.