反義TIMP-1基因轉(zhuǎn)染對(duì)肺纖維化大鼠肺組織TIMP-1和Ⅰ型膠原表達(dá)的影響

唐海英，毛靖?jìng)?，?宇，吳泰華

(1．大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，遼寧 大連 116011； 2．大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 消化內(nèi)科，遼寧 大連 116011； 3．大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 干部病房，遼寧 大連 116011)

肺纖維化是多種慢性肺部疾病的病理過(guò)程，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性肺功能損害，死亡率高，嚴(yán)重威脅人類的健康和生命。致病因素造成各種急性和慢性肺損傷后，引起細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)成分及量的改變，ECM在肺中病理性沉積，造成肺功能異常的重要因素。

ECM的積聚在肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展中起著非常重要的作用[1-4]，然而目前尚無(wú)有效方法阻止ECM的積聚。近年來(lái)，眾多學(xué)者認(rèn)為肺纖維化是ECM合成和降解不平衡的結(jié)果，而降解減弱是引起ECM積聚的重要因素。因此ECM降解減弱在肺、腎、肝等重要臟器纖維化發(fā)生中的作用非常關(guān)鍵[5-6]。本文以博來(lái)霉素(BLM)誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠為模型，并應(yīng)用反義核酸技術(shù)，將正、反義TIMP-1的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到不同階段肺纖維化大鼠模型肺內(nèi)，觀察內(nèi)源性TIMP-1 的表達(dá)變化及肺組織病理形態(tài)學(xué)變化，了解其對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠肺纖維化TIMP-1和Ⅰ型膠原基因和蛋白表達(dá)的影響，為基因治療在將來(lái)臨床肺纖維化治療中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

清潔級(jí)6周齡雌性SD(Sprague-Dawley)大鼠，共210只，體重180～220 g，由遼寧省大連醫(yī)科大學(xué)SPF動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；BLM購(gòu)自日本化藥公司；含正、反義人TIMP-1cDNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及空載體的細(xì)胞上清由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[8]；Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；TIMP-1和Ⅰ型膠原引物由大連寶生物公司合成；TaKaRa RNA PCR kit 3.0(AMV)試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司；羊抗鼠TIMP-1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)RD公司；羊抗鼠Ⅰ型膠原抗體購(gòu)自Santa Cruz生物公司；兔抗山羊SP試劑盒購(gòu)自福州邁新生物公司； DAB顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新公司。

1.2 方 法

1.2.1 分 組：將SD大鼠隨機(jī)分為5組，T1組(正義TIMP-1轉(zhuǎn)染組)、T2組(反義TIMP-1轉(zhuǎn)染組)、T3組(空載體轉(zhuǎn)染組)以及C組(正常對(duì)照組)、C1組(肺纖維化組)，每組SD大鼠42只。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法：T1組、T2組、T3組和C1組大鼠先制作成肺纖維化模型, 具體的方法為：經(jīng)乙醚麻醉后，頸前暴露氣管，一次性氣管內(nèi)注0.4%的BLM生理鹽水注射液(5 mg/kg) ，制成動(dòng)物模型；C組不給予任何干預(yù)措施；T1、T2、T3組為分別在給予BLM后第1, 3, 7, 14, 28, 60, 90天將含正、反義人TIMP - 1cDNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、空載體導(dǎo)入肺纖維化大鼠肺內(nèi)，分別在轉(zhuǎn)染后28 d處死大鼠； C1組僅給予BLM， 時(shí)間與轉(zhuǎn)染組相同；取大鼠右肺迅速置于液氮中凍存，用于RNA提取和RT-PCR；取大鼠左肺于10%甲醛溶液固定，用于病理形態(tài)學(xué)觀察和免疫組織化學(xué)分析。

1.2.3 病理形態(tài)學(xué)觀察：取大鼠左肺石蠟包埋10%甲醛溶液固定肺組織，切片，蘇木素-伊紅(HE)和Masson三色染色。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)及產(chǎn)物定量：按照TRIzol的試劑說(shuō)明書提取總RNA，根據(jù)TaKaRa RNA PCR kit3.0(AMV)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。引物由大連寶生物公司合成，引物如表1。PCR反應(yīng)條件：TIMP-1， 94℃，1 min；51℃，1 min；72℃，90 s；Ⅰ型膠原：94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min； β-actin，94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min；各30個(gè)循環(huán)。RT-PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳后采用凝膠成像系統(tǒng)做積分吸光度(A值)測(cè)定，并以各組目的基因與內(nèi)參照β-actin的比值的變化來(lái)衡量各組不同階段肺組織TIMP-1mRNA 和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)的相對(duì)變化。

表1 目的基因引物序列Tab 1 Oligonucleotide sequences of target gene primers

1.2.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)及圖像分析：利用免疫組織化學(xué)方法分析TIMP-1、Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)變化，常規(guī)免疫組織化學(xué)法處理玻片，所加一抗為羊抗鼠TIMP-1多克隆抗體，效價(jià)1∶5和羊抗鼠Ⅰ型膠原抗體，效價(jià)1∶100，然后按SP試劑盒說(shuō)明進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。利用Image-pro plus 4.5顯微鏡圖像分析系統(tǒng)對(duì)染色陽(yáng)性物質(zhì)進(jìn)行光密度測(cè)定。以高倍鏡(×400)在每張切片上隨機(jī)選取5個(gè)視野，測(cè)定陽(yáng)性部位總光密度值和總面積值，計(jì)算二者比值即陽(yáng)性表達(dá)部位的平均光密度值，該值越大，表明蛋白表達(dá)量越高。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 光鏡下病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

2.1.1 HE染色：正常對(duì)照組大鼠肺組織支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)正常；給予BLM后第1、3天T2組與同一時(shí)間點(diǎn)的C1組和T3組比較肺組織結(jié)構(gòu)較完整，肺泡間隔增厚及間質(zhì)內(nèi)成纖維細(xì)胞增生減輕。而T1組肺組織結(jié)構(gòu)破壞，纖維組織增生明顯(圖1)。給予BLM后第7、14、28、60、90天T1和T2組與同一時(shí)間點(diǎn)的C1、T3組比較無(wú)明顯不同。不同階段進(jìn)行空載體轉(zhuǎn)染與同一時(shí)間點(diǎn)的肺纖維化組比較無(wú)明顯變化。

圖1 給予BLM后第1、3天進(jìn)行轉(zhuǎn)染的光鏡下病理形態(tài)學(xué)改變(HE染色×200)Fig 1 Lung tissue pathological changes under microscope after being transfected following the intratracheal injection of BLM on days 1, 3 (HE staining×200 )

2.1.2 Masson三色染色法：給予BLM后第1、3天T2組與同一時(shí)間點(diǎn)的C1組和T3組比較膠原纖維明顯減少。而T1組膠原纖維增加(圖2)。給予BLM后第7、14、28、60、90天T1和T2組與同一時(shí)間點(diǎn)的C1和T3組比較無(wú)明顯不同。不同階段進(jìn)行空載體轉(zhuǎn)染與同一時(shí)間點(diǎn)的肺纖維化組比較無(wú)明顯變化。

圖2 給予BLM后第1、3天進(jìn)行轉(zhuǎn)染的光鏡下病理形態(tài)學(xué)改變(Masson染色×200)Fig 2 Lung tissue pathological changes under microscope after being transfected following the intratracheal injection of BLM on days 1, 3 (Mason staining×200)

2.2 RT-PCR結(jié)果

給予BLM后第1、3天T2組與同一時(shí)間點(diǎn)的C1和T3組比較TIMP- 1和Ⅰ型膠原表達(dá)減弱(P<0.05)，且T2組TIMP- 1和Ⅰ型膠原表達(dá)仍高于C組(P<0.05)。而T1組表達(dá)增加(P<0.05)。給予BLM后第7、14、28、60、90天T1和T2組兩指標(biāo)的表達(dá)與同一時(shí)間點(diǎn)的C1組、T3組比較無(wú)明顯不同(P>0.05)。見表2、3。

表2 不同時(shí)間肺組織中TIMP-1 mRNA的表達(dá)變化 Tab 2 Lung TIMP-1 mRNA expression at different time-points

T1(正義TIMP-1轉(zhuǎn)染組)、T2(反義TIMP-1轉(zhuǎn)染組)、T3(空載體轉(zhuǎn)染組)、C(正常對(duì)照組)、C1(肺纖維化組)；1)與同一時(shí)間點(diǎn)C1組及T3組比較，P<0.05；2)與C組比較，P<0.05

表3 不同時(shí)間肺組織中I 型膠原mRNA表達(dá)的變化 Tab 3 Lung type I collagen mRNA expression at different time-points

T1(正義TIMP-1轉(zhuǎn)染組)、T2(反義TIMP-1轉(zhuǎn)染組)、T3(空載體轉(zhuǎn)染組)、C(正常對(duì)照組)、C1(肺纖維化組)；1)與同一時(shí)間點(diǎn)C1組及T3組比較，P<0.05；2)與C組比較，P<0.05

2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果

給予BLM后第1、3天T2組與同一時(shí)間點(diǎn)的C1組及T3組比較TIMP- 1和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)減弱(P<0.05)。T1組TIMP- 1和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，且T2組TIMP- 1蛋白和Ⅰ型膠原表達(dá)仍高于正常對(duì)照組(P<0.05)。給予BLM后第7、14、28、60、90天T1和T2組TIMP- 1和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)與同一時(shí)間點(diǎn)的C1組和T3組比較無(wú)明顯不同(P>0.05)。(圖3、4，表4、5)

圖3 給予BLM后第1、3天進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染TIMP-1蛋白的表達(dá)(×400)Fig 3 Lung protein expression of TIMP-1 after being transfected following the intratracheal injection of BLM on days 1, 3 (×400)

圖4 給予BLM后第1、3天進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)(×400)

表4 不同時(shí)間肺組織中TIMP-1蛋白表達(dá)的變化Tab 4 Lung TIMP-1 protein expression at different time-points

T1(正義TIMP-1轉(zhuǎn)染組)、T2(反義TIMP-1轉(zhuǎn)染組)、T3(空載體轉(zhuǎn)染組)、C(正常對(duì)照組)、C1(肺纖維化組)；1)與同一時(shí)間點(diǎn)C1組及T3組比較，P<0.05；2)與C組比較，P<0.05

表5 不同時(shí)間肺組織中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的變化Tab 5 Lung type I collagen protein expression at different time-points

T1(正義TIMP-1轉(zhuǎn)染組)、T2(反義TIMP-1轉(zhuǎn)染組)、T3(空載體轉(zhuǎn)染組)、C(正常對(duì)照組)、C1(肺纖維化組)；1)與同一時(shí)間點(diǎn)C1組及T3組比較，P<0.05；2)與C組比較，P<0.05

3 討 論

氣管內(nèi)注射BLM的方法制作肺纖維化模型是研究肺纖維化的經(jīng)典模型，被廣泛應(yīng)用[9]。目前，已經(jīng)有學(xué)者將構(gòu)建好的反義TIMP-1真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒,以脂質(zhì)體包埋后將其導(dǎo)入大鼠肝、腎纖維化模型內(nèi)并獲得有效表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)纖維化程度明顯減輕[10-15]。本研究的前期工作發(fā)現(xiàn)肺纖維化與TIMP-1有明確的相關(guān)性，并以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體成功地在體外將正義及反義的TIMP-1基因轉(zhuǎn)染至小鼠的成纖維細(xì)胞獲得高效表達(dá)，證實(shí)反義TIMP-1轉(zhuǎn)染可抑制成纖維細(xì)胞增殖、使內(nèi)源性TIMP-1表達(dá)下降，MMPs活性增加，降低培養(yǎng)基中的ECM含量。正義TIMP-1基因作用相反，但是此過(guò)程中MMPs的表達(dá)量并無(wú)變化[16]。

在前期工作的基礎(chǔ)上本研究利用正、反義基因轉(zhuǎn)染動(dòng)物模型，在體內(nèi)探討TIMP-1基因在肺纖維化中的作用。病理形態(tài)學(xué)上發(fā)現(xiàn)第1、3天正義、反義TIMP-1轉(zhuǎn)染組與同一時(shí)間點(diǎn)的肺纖維化組、空載體轉(zhuǎn)染組比較，正義組纖維化程度嚴(yán)重，纖維組織增加及膠原沉積更明顯，反義組相反，且發(fā)現(xiàn)給藥后第3天進(jìn)行正反義TIMP-1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染作用最明顯。余正、反義TIMP-1轉(zhuǎn)染組與同一時(shí)間點(diǎn)的肺纖維化組、空載體轉(zhuǎn)染組差異比較無(wú)顯著性意義。說(shuō)明給藥后第1、3天進(jìn)行反義TIMP-1基因轉(zhuǎn)染可以使纖維化程度減輕，且第3天轉(zhuǎn)染作用更顯著。本研究還分別從基因和蛋白水平對(duì)反義TIMP-1表達(dá)質(zhì)粒的治療作用進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示第1、3天反義TIMP-1轉(zhuǎn)染組與同一時(shí)間點(diǎn)的肺纖維化組、空載體轉(zhuǎn)染組比較內(nèi)源性TIMP-1表達(dá)下降， 細(xì)胞外基質(zhì)成分I型膠原表達(dá)下降，與前期工作體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

TIMPs的表達(dá)變化直接影響MMPs的活性，進(jìn)而影響細(xì)胞外基質(zhì)成分的變化，再結(jié)合轉(zhuǎn)染后病理形態(tài)學(xué)變化，因此認(rèn)為反義轉(zhuǎn)染后內(nèi)源性TIMP-1表達(dá)下降，可能通過(guò)增加MMPs的活性而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，使纖維化程度明顯減輕，并不影響MMPs表達(dá)量的變化。且纖維化早期成纖維細(xì)胞分裂增加，而逆轉(zhuǎn)錄病毒載體僅能感染有絲分裂期的細(xì)胞[17]，此時(shí)轉(zhuǎn)染效率高，作用顯著。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)反義轉(zhuǎn)染后TIMP-1表達(dá)仍高于正常對(duì)照組，說(shuō)明肺纖維化的發(fā)展受多種因素影響，生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子，化學(xué)增活素和凋亡調(diào)節(jié)劑被認(rèn)為與這個(gè)過(guò)程有關(guān)[18]。單一某個(gè)因素的作用不能完全阻止肺纖維化的發(fā)生，反義TIMP-1表達(dá)質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)染僅能在一定程度上抑制肺纖維化的發(fā)展，但是并不能逆轉(zhuǎn)肺纖維化的發(fā)生。纖維化后期無(wú)明顯治療作用，主要考慮在后期膠原已經(jīng)沉積，處于有絲分裂期的細(xì)胞減少，轉(zhuǎn)染效率低至無(wú)所致。說(shuō)明反義TIMP-1基因轉(zhuǎn)染對(duì)已形成的肺纖維化無(wú)顯著作用，故給藥后第7～90天進(jìn)行反義TIMP-1基因轉(zhuǎn)染不能逆轉(zhuǎn)已發(fā)生的肺纖維化。如果改變基因治療中的載體是否會(huì)有更好的治療效果還需進(jìn)一步探討。

肺纖維化的發(fā)病率逐年升高，然而，尚無(wú)有效的治療方法。本研究利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將正義及反義TIMP-1成功地轉(zhuǎn)染到博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠模型肺內(nèi)，并獲得高效表達(dá)。結(jié)果表明給予BLM后第1、3天進(jìn)行反義TIMP-1基因轉(zhuǎn)染使其內(nèi)源性的TIMP-1的表達(dá)受到抑制，在一定程度上抑制肺纖維化的發(fā)生，為TIMP-1反義核酸治療肺纖維化提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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