利用熒光MFLP標(biāo)記技術(shù)分析煙草種質(zhì)的遺傳多樣性

何其芳，李榮華，郭培國*，寧正祥，邱妙文，趙偉才，陳俊標(biāo)，夏巖石，白 盼

（1.廣州大學(xué)植物抗逆基因功能研究廣州市重點(diǎn)研究室，生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510006；2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣州 510640；3.廣東省煙草公司南雄科學(xué)研究所，廣東 南雄 512400；4.廣東省農(nóng)科院作物研究所，廣州 510642）

微衛(wèi)星錨定片段長度多態(tài)性（ Microsatellite-anchored fragment length polymorphism, MFLP）是2001年由Yang等[1]利用AFLP和SSR錨定引物技術(shù)的雙重原理創(chuàng)立了一種新型的分子標(biāo)記技術(shù)，其實(shí)質(zhì)是同時(shí)探查限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)和限制性片段內(nèi)堿基序列、微衛(wèi)星重復(fù)基元的變異，具有AFLP多態(tài)性豐富和具有SSR共顯性等優(yōu)點(diǎn)[2]。另外，MFLP多態(tài)性不需經(jīng)過冗長繁瑣的實(shí)驗(yàn)過程，就能轉(zhuǎn)化獲得序列特異性的SSR或PCR標(biāo)記[1,3]。利用該技術(shù)，分析了多種作物的生物多樣性、構(gòu)建了遺傳連鎖圖、并發(fā)現(xiàn)了與抗病性和品質(zhì)相關(guān)的MFLP標(biāo)記[1,3-5]。

煙草是重要經(jīng)濟(jì)作物之一，但在利用分子標(biāo)記技術(shù)方面，與其他作物相比，仍有較大差距。主要體現(xiàn)在大量研究主要利用穩(wěn)定性和重復(fù)性較差的RAPD技術(shù)[6-7]，近來有報(bào)道利用AFLP技術(shù)開展煙草材料的遺傳多樣性分析[8-9]；而煙草 SSR標(biāo)記技術(shù)的研究起步晚，直到2007年Bindler等[10]首次報(bào)道如何開發(fā)煙草的SSR標(biāo)記，并利用開發(fā)出的282個(gè) SSR標(biāo)記構(gòu)建了遺傳連鎖圖譜。隨后利用這些SSR標(biāo)記，分析了煙草品種的多樣性及進(jìn)化關(guān)系等[11-13]，但在種質(zhì)遺傳多態(tài)性分析實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這些SSR在烤煙上只有20個(gè)能擴(kuò)增出具有明顯SSR特性（如共顯性）的擴(kuò)增條帶[13]。直到現(xiàn)在還未見利用MFLP技術(shù)開展煙草遺傳特性分析方面的研究報(bào)道。另外，MFLP技術(shù)均采用放射性同位素進(jìn)行標(biāo)記[1,4-5]，該技術(shù)存在著一系列令人困擾的問題，通常在普通實(shí)驗(yàn)室中難以開展，如果能將熒光標(biāo)記技術(shù)成功運(yùn)用到MFLP中將能夠大大提高實(shí)驗(yàn)的安全性并降低實(shí)驗(yàn)成本，更加有利于MFLP技術(shù)的發(fā)展。

本研究以 32份煙草種質(zhì)為材料，利用我們建立的煙草MFLP熒光標(biāo)記分析體系，將M13通用熒光接頭連接在設(shè)計(jì)的 SSR錨定引物上對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記，并對煙草種質(zhì)材料進(jìn)行多態(tài)性分析，為熒光MFLP技術(shù)在煙草遺傳多樣性及其他遺傳特性分析的研究和應(yīng)用提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 煙草種質(zhì)材料及基因組DNA的提取

本試驗(yàn)選用的 32份煙草種質(zhì)材料由廣東省農(nóng)科院作物所提供，種質(zhì)材料的序號、名稱、來源和類型如表1所示。2010年盆栽種植煙草各材料，在幼苗期采收葉片，按李榮華等[14]改良的CTAB法，提取各材料的基因組DNA，并將提取的煙草DNA濃度稀釋到100 ng/μL后作為MFLP的模板。

表1 煙草種質(zhì)材料及來源Table 1 Tobacco germplasm and origins

1.2 引物和試劑

熒 光 引 物 M13-F-IRDye 700（5′-CACGACGTTGTAAAACGAC-3′）購自美國LICOR公司，SSR錨定引物、帶M13接頭的SSR錨定引物（即加尾 SSR錨定引物）、MseI接頭和MseI引物、實(shí)驗(yàn)所需的酶及試劑均購自上海生物工程有限公司合成。MFLP中使用的引物信息見表2。

表2 MFLP預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增的引物Table 2 MFLP primers used in pre- and selective-amplification

1.3 熒光MFLP標(biāo)記技術(shù)

依據(jù)Yang等[1]MFLP技術(shù)的原理，結(jié)合熒光標(biāo)記技術(shù)，建立了煙草熒光MFLP標(biāo)記技術(shù)，具體過程如下：

1.3.1 酶切和連接 取MseI adapter-1（100 pM）和MseI adapter-2（100 pM）各 62 μL，混均后在 95 ℃水浴5 min，取出后放在操作臺上冷卻20 min，作為MseI adapter備用。MseI酶切反應(yīng)液總體積為30 μL，包括 DNA（100 ng/μL）3.0 μL，MseI酶（10 U/μL）0.6 μL，10×buffer R 3.0 μL，雙蒸水 23.4 μL，在 37℃條件下酶切2 h，之后在80 ℃條件下保溫20 min終止反應(yīng)；之后在MseI酶切產(chǎn)物中加入MseI adapter 1 μL，10×ligase buffer 2 μL，T4 DNA 連接酶(5 U/μL) 0.2 μL，雙蒸水 6.8 μL，在 20℃條件下反應(yīng)5 h，在65℃條件下保溫10 min終止反應(yīng)，此液為連接后產(chǎn)物。隨后取 10 μL連接產(chǎn)物，2 μL 10×buffer R，2 μLHaeIII酶（10 U/μL），12 μL 雙蒸水，37℃條件下再次酶切 3 h，酶切后產(chǎn)物加入80 μL TE0.1（10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA pH 8），作為預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)的DNA模板。

1.3.2 預(yù)擴(kuò)增 預(yù)擴(kuò)增PCR反應(yīng)體積為30 μL，含預(yù)擴(kuò)增模板 6 μL，Taq DNA Polymerase（5 U/μL）0.45 μL，SSR 錨定引物（10 μM）1.5 μL，MseI引物（10 μM）1.5 μL，10×PCR buffer 3.0 μL，Mg2+（20 mM）3.6 μL，10 mM dNTP 0.9 μL，雙蒸水13.05 μL。PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性2 min，25個(gè)PCR循環(huán)（94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min）。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物用TE0.1稀釋10倍后即是選擇性擴(kuò)增的DNA模板。

1.3.3 選擇性擴(kuò)增及檢測 選擇性擴(kuò)增的 PCR反應(yīng)體積為10 μL，含選擇性擴(kuò)增模板1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.15 μL，加尾 SSR 錨定引物（1 μM）0.6 μL，10×PCR buffer 1.0 μL，Mg2+（20 mM）1.2μL，10 mM dNTP 0.3 μL，熒光引物 M13-F（0.1 μM）0.5 μL，MseI選擇性擴(kuò)增引物0.6 μL，雙蒸水4.65 μL。選擇性擴(kuò)增的 PCR 程序如下：94 ℃ 30 s、60 ℃（每個(gè)循環(huán)下降0.7 ℃）30 s、72 ℃ 1 min，循環(huán)9次；再按 94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 循環(huán)25次。擴(kuò)增產(chǎn)物利用LI-COR 4300 DNA遺傳分析儀（LI-COR Biosciences, USA）進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳掃描檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析方法

依據(jù)熒光掃描圖譜的結(jié)果，用“1”（有）和“0”（無）記錄譜帶，把圖形資料轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)資料。利用NTSYS2.0e軟件，以除權(quán)配對法（UPGMA）[15]進(jìn)行SAHN聚類分析和主坐標(biāo)分析，并計(jì)算出樣本間的遺傳相似系數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 選擇性擴(kuò)增引物對的篩選與煙草種質(zhì)材料的MFLP多態(tài)性分析

利用 D101、RG17、長脖黃和 C151作材料，分析MFLP選擇性擴(kuò)增引物組合的擴(kuò)增效果來確定適宜的引物組合。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5個(gè)加尾SSR錨定引物（fGTCC(GA)6、fCCCA(AG)7、fGGCT(AAG)5、fGACG(AAC)5和fCCAG(CTT)5）分別與 16種MseI選擇性擴(kuò)增引物組合后擴(kuò)增出60～700 bp之間熒光強(qiáng)度強(qiáng)弱不一的條帶；但有些引物組合的擴(kuò)增條帶大多集中在低分子量部分，有的引物組合擴(kuò)增出的條帶雖多但在4個(gè)種質(zhì)材料間沒有發(fā)現(xiàn)多態(tài)性。經(jīng)過比較分析后發(fā)現(xiàn)，15對引物組合（表3）的擴(kuò)增產(chǎn)物在4個(gè)種質(zhì)材料間具有明顯多態(tài)斑且清晰易辨，這 15個(gè)選擇性引物組合將用于煙草種質(zhì)材料的MFLP分析。

利用篩選出的選擇性擴(kuò)增引物組合分析 32份煙草種質(zhì)，共擴(kuò)增出1 122個(gè)條帶，其中有64個(gè)具多態(tài)性（表3），多態(tài)性占總擴(kuò)增帶數(shù)的5.7%，表明參試資源的遺傳多樣性不是非常明顯。其中每個(gè)組合可以得到2～13個(gè)清晰易辨的多態(tài)性條帶（圖1），表明不同引物組合的擴(kuò)增效率差異很大。另外，不同來源、類型煙草材料間存在的多態(tài)性數(shù)目和比例差異相對較大。巴西曬晾煙擴(kuò)增出 46條多態(tài)性帶，多態(tài)性比例為4.1%；革雜基擴(kuò)增出34條多態(tài)性帶，多態(tài)性比例為 3.0%；其他來源的參試資源的相關(guān)數(shù)據(jù)介于二者之間。這些多態(tài)性主要分布在80～400 bp。

表3 篩選出的選擇性擴(kuò)增引物組合及其擴(kuò)增片段具有的多態(tài)性Table 3 MFLP fragments and polymorphic bands detected from each selective primer combinations

圖1 煙草種質(zhì)材料的一個(gè)MFLP電泳圖Fig.1 An MFLP gel showing polymorphic bands among 32 tobacco varieties.

2.2 煙草種質(zhì)材料的聚類分析

32份煙草種質(zhì)兩兩間的相似系數(shù)在 0.40到0.83之間，其中D101（美國烤煙）和革新六號（山東烤煙）之間最小，相似系數(shù)才0.40，RG17（美國烤煙）和CO139（美國烤煙）之間的相似系數(shù)最大，為0.83。根據(jù)遺傳相似系數(shù)，用非加權(quán)組平均法如圖2。從圖中可看出，取相似系數(shù)為0.60進(jìn)行第1等級劃分，可將32份煙草材料分成5大類。C212、NC60和金星均各成一大類。第4大類的平均相似系數(shù)約為0.62，它在相似系數(shù)約為0.68處又可以分成3小組，第1組包括D101、RG17、長脖黃、C151、CO139、CO176、K149、K326、革雜基和翠碧一號，全部都是烤煙，其中6個(gè)來自美國，其他都來自中國，其中RG17和CO139的相似系數(shù)最大，種質(zhì)間的親緣關(guān)系最近；第2組包括G28、K358、K399、K730、OX2028、R-158、RG11、RG-22和RG-8均是美國烤煙，其中，K730和OX2028的親緣關(guān)系最近；第3組包括CV087和NC95。第5大類的平均相似系數(shù)也約為0.62，它在0.68處也可以分成3小組，第1組包括K346和豐字一號，第2組是KY26、巴西曬晾煙和大白筋599，第3組是Atnarello毛晾、革新六號和紅花大金元。

圖2 32份煙草種質(zhì)材料的基于MFLP多態(tài)性數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成遺傳多態(tài)性的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram depicting patterns of genetic diversity estimated by MFLP marker alleles among 32 tobacco varieties

從以上的聚類結(jié)果來看，大部分來自美國的烤煙品種很好地聚類到了一起，3個(gè)白肋煙都包含在第5大類之中，但總體而言并沒有明顯地分辨出白肋煙和烤煙的區(qū)別，反而是來自廣東的烤煙C212、美國的烤煙NC60和山東的烤煙金星和其他品種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其遺傳差異性較大。

2.3 依據(jù)MFLP標(biāo)記的32份煙草種質(zhì)的主坐標(biāo)分析

對32份煙草種質(zhì)的MFLP標(biāo)記的原始矩陣進(jìn)行主坐標(biāo)分析，前3個(gè)主坐標(biāo)所能解釋的相關(guān)性分別為12.4%、10.6%和8.3%。32份種質(zhì)的第1和第2主坐標(biāo)、第1和第3主坐標(biāo)的二維圖排序如圖3所示。

圖3 依據(jù)MFLP標(biāo)記對煙草種質(zhì)進(jìn)行主坐標(biāo)分析的第1與第2（左）、第1與第3（右）主座標(biāo)散點(diǎn)圖Fig.3 Principal coordinate map for the first and second (left ), the first and third (right) coordinates estimated for MFLP marker alleles by means of the genetic similarity matrix for 32 tobacco varieties

綜合第1和第2座標(biāo)及第1和第3座標(biāo)排序，可將煙草種質(zhì)材料分成4類11個(gè)組。第1類共有3個(gè)白肋煙5個(gè)烤煙，分成3組；第1組包括KY26、革雜基、大白筋599，第2組包括K346、Atnarello毛晾、巴西曬晾煙，第3組為翠碧一號和豐字一號。第2類的9個(gè)烤煙可分成3組，第1組包括D101、CO139、CO176、K326、長脖黃和C151，第2組為RG17和RG-22，第3組為K149。第3類的9個(gè)烤煙材料亦分成3組，其中第1組為CV087和NC95，第2組為K399，第3組全來自美國的烤煙，包括G28、K730、NC60、OX2028、RG11、RG-8。第 4類則分成2組，第1組為K358，第2組包括C212、R-158、革新六號、紅花大金元和金星。

主坐標(biāo)分析能從不同方向、不同層面更加直觀地顯示各品種間的關(guān)系，可進(jìn)行更加細(xì)致精確的歸類。在以往的親緣關(guān)系研究中，多采用系統(tǒng)聚類法，這對于反映親緣關(guān)系很近的種質(zhì)之間的關(guān)系來說很有效，但對于親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種質(zhì)之間的聚類，卻顯得信息量不足。因此，將系統(tǒng)聚類分析和主坐標(biāo)分析結(jié)合起來使用，相互補(bǔ)充、驗(yàn)證，能為闡明煙草種質(zhì)之間的親緣關(guān)系提供更全面的信息[16]。

3 討 論

3.1 熒光標(biāo)記技術(shù)

Yang等[1]建立的MFLP分析技術(shù)采用放射性同位素進(jìn)行標(biāo)記，但存在著一系列令人困擾的問題，如成本高、探針半衰期短、放射性物質(zhì)危害人體健康等；另外還需要有專門的實(shí)驗(yàn)室、相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)保護(hù)設(shè)施和專業(yè)人員，因而限制了在普通實(shí)驗(yàn)室開展研究工作，而采用熒光標(biāo)記技術(shù)則不存在上述問題。因此，本研究通過將M13通用熒光接頭連接在設(shè)計(jì)的SSR引物上，對操作者而言安全系數(shù)高。另外，與國內(nèi)較常用的銀染相比，熒光標(biāo)記的效率明顯高于銀染，能得到更多更全的基因組變異信息，所花時(shí)間也短，而且從總體上而言，在不討論設(shè)備成本的前提下，熒光標(biāo)記的總成本會(huì)低于銀染[17]。

3.2 煙草品種的遺傳多樣性

根據(jù)本試驗(yàn)聚類分析和主坐標(biāo)分析結(jié)果，難以完全確定來自不同國家和地區(qū)的煙草品種材料，只是當(dāng)類分得很細(xì)時(shí)可將一部分美國烤煙品種單獨(dú)組成一組（主坐標(biāo)分析中第3類的第3組），這表明供試煙草品種的地理來源與遺傳差異之間并沒有必然的聯(lián)系，當(dāng)然也有一部分原因是國內(nèi)許多品種來源于美國品種，因此親緣關(guān)系較近。3個(gè)白肋煙品種也沒有與其他烤煙品種表現(xiàn)出很明顯的區(qū)別，只是表現(xiàn)出三者之間的親緣關(guān)系相對較近，且均聚集在一個(gè)大類中（聚類分析中均在第 5大類中），在一定程度上預(yù)示了兩大品種間應(yīng)該還是存在一定的差異。本研究從分子水平上一定程度地印證了目前我國煙草品種資源的匱乏，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果與肖炳光等[18]的報(bào)道類似，均未體現(xiàn)出地域性差異對聚類結(jié)果有明顯的影響。因此，在今后的煙草育種中應(yīng)該更多地考慮被聚集在不同類中的煙草資源，而不是單純地考慮其來源地。

3.3 MFLP分子標(biāo)記在煙草遺傳分析中的應(yīng)用分析

但迄今為止，煙草上運(yùn)用較多且較為成熟的分子標(biāo)記技術(shù)還是RAPD標(biāo)記，其他標(biāo)記類型則運(yùn)用較少；而RAPD標(biāo)記最大的缺點(diǎn)是引物為單鏈且短，對反應(yīng)條件較為敏感，重復(fù)性差[19]。簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性（ISSR）擴(kuò)增產(chǎn)物的重復(fù)性和穩(wěn)定性亦不很理想，擴(kuò)增效果類似于或略高于RAPD[20]；AFLP技術(shù)的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較高，多態(tài)性豐富，適合于作物的遺傳分析[8,21-22]，但它與RAPD、ISSR等標(biāo)記一樣，擴(kuò)增產(chǎn)物基本上都具有多個(gè)位點(diǎn)的顯性標(biāo)記，并且難以將其中感興趣的位點(diǎn)轉(zhuǎn)換成序列特異性且操作簡便的PCR標(biāo)記[1,22]。SSR標(biāo)記操作簡便，穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好，共顯性、序列特異性強(qiáng)，但煙草中發(fā)現(xiàn)SSR的數(shù)量仍限于Bindler等[10]開發(fā)的282個(gè)煙草的SSR標(biāo)記，明顯難以滿足開展煙草研究和應(yīng)用的需要。而MFLP技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合了SSR和AFLP標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，具有多態(tài)性豐富、重復(fù)性和穩(wěn)定性好、且有高比例共顯性等優(yōu)點(diǎn)，并且很容易將具多態(tài)性的MFLP片段轉(zhuǎn)換成序列特異性且操作簡單的PCR標(biāo)記（主要是SSR標(biāo)記）[1,3]；這樣運(yùn)用MFLP技術(shù)開展煙草遺傳分析的同時(shí)，還可開發(fā)具有多態(tài)性的煙草SSR標(biāo)記。因此，本實(shí)驗(yàn)熒光MFLP技術(shù)在煙草遺傳分析成功應(yīng)用，不僅能為煙草種質(zhì)材料的分類提供更多依據(jù)，還可為開發(fā)出煙草的序列特異性PCR標(biāo)記、促進(jìn)煙草DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

在 Yang等 2001年建立的利用放射性同位素MFLP分子標(biāo)記技術(shù)的基礎(chǔ)上，我們建立了適合于煙草的熒光MFLP分子標(biāo)記技術(shù)體系。利用此體系檢測了32份煙草種質(zhì)材料的MFLP多態(tài)性，所得的煙草MFLP熒光圖譜的條帶清晰易辨且多態(tài)性豐富，結(jié)合聚類分析能有效地將這些煙草種質(zhì)材料的來源和類型進(jìn)行分類，表明熒光MFLP技術(shù)可較好地用于開展煙草遺傳特性分析的研究和應(yīng)用工作。

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