三七總皂苷對大鼠心肌缺血的保護(hù)作用

韓淑燕，馬旭，李海霞，張可，屠鵬飛

(1.北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100191;2.北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院北京腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

北京100142;3.國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作中心，北京100183)

三七總皂苷對大鼠心肌缺血的保護(hù)作用

韓淑燕1，2，馬旭1，3，李海霞1，張可1，屠鵬飛1

(1.北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100191;2.北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院北京腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

北京100142;3.國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作中心，北京100183)

目的探討三七總皂苷(PNS)預(yù)處理對急性心肌缺血的作用。方法SD大鼠ig給予PNS 25～800 mg·kg－1，每天2次連續(xù)7次，末次給藥30 min后，結(jié)扎冠狀動脈前降支缺血24 h。氯化三苯基四氮唑染色法測定心肌梗死面積，頸總動脈插管測定左心室內(nèi)血流動力學(xué)變化，自動生化分析儀檢測心肌酶譜。結(jié)果與急性心肌缺血模型組相比，PNS 50，100，200和400 mg·kg－1能顯著降低心肌缺血大鼠的心肌梗死面積(P＜0.05)，降低心肌缺血后左心室舒張末壓，提高左心室收縮壓，增強(qiáng)等容收縮期左心室內(nèi)壓最大上升速率和等容舒張期左心室內(nèi)壓最大下降速率;顯著降低血清中乳酸脫氫酶和肌酸激酶活性，降低α-羥丁酸脫氫酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性。結(jié)論P(yáng)NS在50～400 mg·kg－1劑量范圍內(nèi)能顯著降低心肌缺血大鼠的心肌梗死面積，提高左心室舒張和收縮功能，明顯抑制急性心肌缺血大鼠心肌酶的釋放，具有改善心肌缺血的作用。

三七總皂苷;心肌缺血;左心室功能;心肌酶

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，氣虛血瘀是冠心病的主要病機(jī)，益氣活血為其主要治則。三七為臨床常用的益氣活血藥，為治療缺血性心血管疾病的常用中藥。皂苷類成分是三七的主要活性物質(zhì)基礎(chǔ)，目前已從中分離得到70多種單體皂苷成分［1－2］。三七總皂苷(extract of Panax notoginseng saponins，PNS)能改善冠脈循環(huán)，降低心肌耗氧量，具有改善心肌供血、保護(hù)心肌的作用。對PNS抗心肌缺血作用的評價及機(jī)制探討一直是抗心肌缺血藥物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

左冠狀動脈前降支(left anterior descending of the coronary artery，LAD)支配的范圍常常是臨床上心肌梗死的好發(fā)部位，結(jié)扎大鼠LAD所導(dǎo)致的心肌梗死模型是在體評價抗心肌缺血藥物的重要模型，也是國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的方法［3－4］。本研究采用結(jié)扎大鼠LAD所導(dǎo)致的心肌梗死模型，通過測定心肌梗死范圍、左心室功能和血清酶學(xué)等指標(biāo)，系統(tǒng)研究較大劑量范圍PNS對心肌缺血的改善作用，為相關(guān)的研究提供劑量范圍參考。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

PNS，云南植物藥業(yè)有限公司，批號:HB20060352，經(jīng)HPLC測定含人參皂苷Rg132.39%，Rb133.06%，三七皂苷R15.91%［5］。氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)，北京馬氏精細(xì)化學(xué)品有限公司;戊巴比妥鈉，北京化學(xué)試劑公司，德國進(jìn)口分裝;肝素鈉注射液，江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司;肌酸激酶(creatine kinase，CK)試劑盒和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒，北京中生北控生物科技股份有限公司。

1.2 主要儀器

HX-300動物呼吸機(jī)和BL-420S生物機(jī)能儀，成都泰盟科技有限公司;TGL-16G-A高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠;日立7600全自動生化分析儀，日本;SHIMADZU紫外-可見分光光度計(jì)，日本;BS 110S電子天平，德國Sartorius;SANYO超低溫冰箱(－80℃)，日本;WSZ-261-79電熱恒溫水浴箱，上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠。

1.3 動物分組和給藥

Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，體質(zhì)量(250±30)(±s)g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號:SCXK(京)2002-0001。大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為8組，每組10只。大鼠分別ig給予PNS 25，50，100，200，400，600和800 mg·kg－1，模型組給予等量的溶劑，每天2次，連續(xù)給藥7次，末次給藥30 min后，結(jié)扎冠狀動脈前降支制備急性心肌缺血模型。

1.4 急性心肌缺血動物模型的制備

大鼠ip給予1%戊巴比妥鈉50 mg·kg－1麻醉，四肢皮下連接心電圖電極，記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。經(jīng)口插氣管，連接動物呼吸機(jī)，呼吸頻率70～75 min－1，潮氣量40～60 ml·kg－1。于左側(cè)第四肋間開胸，輕擠出心臟，用6/0絲線在肺動脈圓錐和左心耳交界下緣1～2 mm結(jié)扎，迅速把心臟放回胸腔，以結(jié)扎部分發(fā)紺、膨出和心電圖ST段抬升作為結(jié)扎成功的標(biāo)志［4］。假手術(shù)組僅在左前降支相應(yīng)位置穿針而不打結(jié)，其余操作與手術(shù)組相同。手術(shù)后觀察10 min，擠出胸腔內(nèi)空氣并逐層關(guān)胸，恢復(fù)大鼠自主呼吸，拔出氣管插管并清除氣管內(nèi)分泌物，給予飼料和水喂養(yǎng)24 h。

實(shí)驗(yàn)過程中，所有因手術(shù)、麻醉意外等原因死亡的以及術(shù)后存活時間未達(dá)到取材時間要求的大鼠，均不列入實(shí)驗(yàn)觀察項(xiàng)目之內(nèi)。

1.5 心功能檢測

大鼠結(jié)扎冠狀動脈左前降支24 h后，ip給予1%戊巴比妥鈉50 mg·kg－1麻醉，仰臥位固定，頸部正中切開皮膚，止血鉗鈍性分離頸部肌肉，暴露出右側(cè)頸總動脈。近頭端用絲線穿過，遠(yuǎn)端用動脈夾夾住，在右頸總動脈上剪一V型切口，插入充滿300 kU·L－1肝素生理鹽水溶液的導(dǎo)管，并用絲線固定。松開動脈夾，將肝素化PE導(dǎo)管經(jīng)右頸總動脈插管至左心室，根據(jù)顯示器所示壓力圖形改變，判斷插管是否進(jìn)入心室腔［6］。導(dǎo)管另一頭連接于壓力換能器，將信號輸入BL-420S生物信號采集分析系統(tǒng)，以監(jiān)測左心室血流動力學(xué)變化。插入左心室平衡30 min后，記錄左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)，同時將左心室壓力電信號同步輸入微分器，測得等容收縮期左心室內(nèi)壓最大上升速率(maximum rate of increase in left ventricular pressure，+dp/dtmax)和等容舒張期左心室內(nèi)壓最大下降速率(maximum rate of decrease in left ventricular pressure，－dp/dtmax)。

1.6 TTC 染色測定心肌梗死面積［7］

心功能檢測完畢后，迅速取出心臟，置冰冷生理鹽水中沖洗除去血污，剔除心房、血管、脂肪等非心肌組織，置于－20℃冰箱放置30 min。在心臟結(jié)扎線下，平行冠狀溝將心臟自心尖至心底部橫切成5片(厚1.5～2 mm)，置于1%TTC磷酸鹽緩沖液中(pH 7.4)于37℃恒溫水浴中孵育10 min。將染色后的心臟橫切片置于4%多聚甲醛溶液中固定，掃描心臟切片的正反兩面，用Photoshop軟件計(jì)算梗死范圍，以梗死面積占全心室面積的百分比表示［8］。

1.7 血清心肌酶的檢測

心功能檢測完畢后，腹主動脈取血，于1170×g 4℃下離心15 min，得到血清樣品，凍于－80℃冰箱備用。血清心肌酶譜檢測包括CK、LDH、α-羥丁酸脫氫酶(α-hydroxybutyrate dehydrogenase，α-HBDH)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-pyruvic trunsaminase，GPT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT)，采用日立7600全自動生化分析儀進(jìn)行測定。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 三七總皂苷預(yù)處理對心肌缺血損傷大鼠梗死面積的影響

圖1和表1結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的心肌出現(xiàn)大面積TTC不著色區(qū)域，表明有顯著的心肌梗死，模型制備成功。經(jīng)PNS預(yù)處理的心臟切片中TTC不能染色區(qū)域有所縮小，其中PNS 50，100，200和400 mg·kg－1組大鼠的心肌梗死范圍顯著縮小(P＜0.05)，而PNS 600和800 mg·kg－1預(yù)處理組心肌梗死比例無明顯縮小，可能是過高劑量的PNS因產(chǎn)生毒性而失去了心肌保護(hù)作用。

Fig.1 Effect of Panax notoginseng saponins(PNS)on myocardial ischemia induced by left anterior descending coronary artery ligation in rats.The rats were ig given PNS，twice a day，for 7 d.After the last administration for 30 min，the acute myocardial ischemia model was induced by left anterior descending coronary artery ligation.The infarct size was showed by TTC staining.A:sham;B:model;C－I:PNS 25，50，100，200，400，600 and 800 mg·kg－1，respectively.

Tab.1 Effect of extract of PNS on infarct size in ischemic rats

2.2 三七總皂苷預(yù)處理對心肌缺血大鼠心功能的影響

表2結(jié)果顯示，心肌缺血24 h后，模型組大鼠的心功能明顯減弱，左心室收縮和舒張功能出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為±dp/dtmax和LVSP下降，LVEDP升高。與模型組相比，PNS 800 mg·kg－1對血流動力學(xué)各指標(biāo)的改善均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PNS 25 mg·kg－1對LVSP和+dp/dtmax的改善也沒有顯著性差異，PNS 50，100，200，400和600 mg·kg－1預(yù)處理能顯著改善心功能(P＜0.05)。結(jié)果提示，PNS對心肌缺血損傷所致的心功能障礙有一定的改善作用。實(shí)驗(yàn)期間各組心率無顯著差異。

2.3 三七總皂苷預(yù)處理對心肌缺血大鼠血清心肌酶的影響

心肌缺血24 h后，模型組大鼠血清CK，LDH，α-HBDH和GOT水平明顯升高。與模型組相比，PNS各給藥組的LDH和CK水平出現(xiàn)顯著性降低(P＜0.05)。除PNS 25 mg·kg－1和800 mg·kg－1組外，其余劑量組的GOT和α-HBDH出現(xiàn)顯著性下降(P＜0.05)。PNS各劑量組對GPT的作用與模型組相比沒有顯著性差異(表3)。

Tab.2 Effect of PNS on hemodynamic parameters in ischemic rats

Tab.3 Effect of PNS on myocardial enzymes in ischemia rats

3 討論

本研究結(jié)果顯示，結(jié)扎大鼠LAD 24 h后，左心室明顯出現(xiàn)心肌梗死，說明造模是成功的。PNS 50，100，200和400 mg·kg－1均可顯著降低大鼠冠脈結(jié)扎后心肌梗死范圍，表明PNS對大鼠冠脈結(jié)扎所致心肌缺血有顯著的保護(hù)作用。

心肌缺血往往伴隨心臟血流動力學(xué)改變，心肌缺血損傷發(fā)生較早、程度較嚴(yán)重的病理生理變化是左心室舒張功能的損傷［9］，本實(shí)驗(yàn)大鼠AMI后，±dp/dtmax顯著降低，提示左心室收縮、舒張功能均顯著受損，這主要是與梗死區(qū)域心肌細(xì)胞壞死、功能喪失有關(guān)。從本研究結(jié)果來看，PNS預(yù)處理對左心室舒張功能改善最為顯著，給予不同劑量PNS后，LVEDP顯著降低，－dp/dtmax明顯增加，除PNS 800 mg·kg－1外的其他劑量組均有顯著性差異。PNS亦能提高左心室收縮功能，表現(xiàn)在升高LVSP和+dp/dtmax的增加，除PNS 25和800 mg·kg－1外的其他劑量組具有顯著性差異。從血流動力學(xué)結(jié)果來看，PNS對梗死后心功能有很好的改善作用，劑量范圍在50～400 mg·kg－1具有較好的療效，隨著劑量的增加其心功能改善作用減弱，與心肌梗死面積的結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示，PNS預(yù)處理后可明顯抑制實(shí)驗(yàn)性急性心肌缺血大鼠心肌損傷時CK，LDH，α-HBDH的溢出，保護(hù)心肌細(xì)胞。PNS 50～400 mg·kg－1對GOT有效，但模型組和PNS各組GPT無顯著性差異。GPT主要用于肝疾病的診斷和鑒別診斷，常和GOT聯(lián)合應(yīng)用，若GOT＞GPT則提示發(fā)生了心肌病變。雖然這幾種酶都不是心肌所特有的，但綜合考慮對心肌損傷的診斷具有特征性。

本研究結(jié)果顯示，PNS可顯著降低大鼠冠脈結(jié)扎后心肌梗死范圍，改善心梗后大鼠的心臟功能，而且可以降低大鼠冠脈結(jié)扎后血清LDH，CK，GOT和HBDH活性的升高，表明PNS對結(jié)扎冠狀動脈所致的心肌缺血有保護(hù)作用，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［10－12］。在本研究中，PNS各劑量組對心肌缺血的評價指標(biāo)都有不同程度的改善，但未出現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，推測可能與總皂苷部位成分復(fù)雜，各成分之間相互影響等因素有關(guān)?？傮w趨勢是PNS 25 mg·kg－1改善心肌缺血的作用較弱，PNS 50，100，200和400 mg·kg－1對心肌缺血損傷有顯著的保護(hù)作用，但PNS 600～800 mg·kg－1對心肌缺血的保護(hù)作用逐漸消失，說明劑量過高或過低均不能有效地改善心肌缺血所致的損傷，從而為以后的相關(guān)研究確定了一個適宜的劑量范圍。

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Protective effect of Panax notoginseng saponins on acute myocardial ischemia in rats

HAN Shu-yan1，2，MA Xu1，3，LI Hai-xia1，ZHANG Ke1，TU Peng-fei1
(1.State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs，School of Pharmaceutical Sciences，Peking University，B
e
ijing100191，China;2.School of Oncology，Beijing Cancer Hospital＆Institute，Key Laboratory of Carcinogenesis and Translational Research，Peking University，Beijing100142，China;3.Patent Examination Cooperation Center of SIPO，Beijing100183，China)

OBJECTIVETo explore the effect of Panax notoginseng saponins(PNS)pretreatment on acute myocardial ischemia in rats.METHODSThe rats were ig given PNS 0，25，50，100，200，400，600 and 800 mg·kg－1，twice a day，for 7 times.After the last administration for 30 min，the acute myocardial ischemia model was induced by left anterior descending coronary artery ligation.The percentage of the myocardial infarct size was determined by TTC staining after 24 h，and left ventricular carotid artery blood flow dynamics was monitored by a biological signal acquisition and analysis system.Meanwhile，the cardiac enzymes related to myocardial infarction were assayed by an automatic biochemical analyzer.RESULTSCompared with model group，PNS 50，100，200 and 400 mg·kg－1pretreatment significantly reduced infarct size in myocardial ischemia rats，decreased left ventricular end-diastolic pressure，improved left ventricular systolic pressure，and increased the maximum rate of increase/decrease in left ventricular pressure.Serum levels of lactate dehydrogenase and creatine kinase were significantly lowered;α-hydroxybutyrate dehydrogenase and aspartate aminotransferase were also obviously decreased.CONCLUSIONPNS 50－400 mg·kg－1could significantly reduce myocardial infarct size，improve left ventricular diastolic and systolic function and inhibit the release of myocardial enzymes.

Panax notoginseng saponins;myocardial ischemia;left ventricular function;cardiac enzymes

The project supported by National Science Fund for Distinguished Young Scholars(30525043)

TU Peng-fei，Tel:(010)82802750，E-mail:pengfeitu@vip.163.com

R973，R285.5

A

1000-3002(2012)04-0499-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.04.006

國家杰出青年基金資助課題(30525043)

韓淑燕(1973－)，女，副研究員，主要從事天然藥物活性成分的藥效及作用機(jī)制研究;屠鵬飛(1963－)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事天然藥物活性成分與新藥研究。

屠鵬飛，E-mail:pengfeitu@vip.163.com，Tel:(010)82802750

2011-08-10接受日期:2011-11-29)

(本文編輯:喬虹)