黃芩含藥血清對(duì)脂多糖刺激大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用

崔曉燕，張敏，杜增輝，韓文華

(河北省食品藥品檢驗(yàn)院，河北石家莊050011)

黃芩含藥血清對(duì)脂多糖刺激大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用

崔曉燕，張敏，杜增輝，韓文華

(河北省食品藥品檢驗(yàn)院，河北石家莊050011)

目的探討黃芩提取物(SBE)含藥血清對(duì)細(xì)菌脂多糖(LPS)引起的大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞活化的抑制作用。方法大鼠ig給予SBE 25 g·kg－1，給藥后0.5～6 h眼底靜脈叢取血，制備SBE含藥血清。將SBE含藥血清(終濃度10%)和LPS(終濃度1 mg·L－1)與大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)24 h。采用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率;Griess還原法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中一氧化氮(NO)含量;用超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定試劑盒測(cè)定SOD活性;分別用微量丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量測(cè)定試劑盒測(cè)定MDA和GSH含量。結(jié)果在不影響細(xì)胞存活率的情況下，不同時(shí)間點(diǎn)的SEB含藥血清可以顯著降低LPS刺激的大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO和MDA的含量，SEB 0.5，1和2 h的含藥血清使NO由LPS對(duì)照組的(14.2±0.8)μmol·L－1分別降低至12.9±0.6，9.2±0.6和(9.9±0.4)μmol·L－1(P＜0.05);SEB 1，2和3 h的含藥血清使MDA由LPS對(duì)照組的(13.4±0.7)μmol·L－1分別降低至9.42±0.64，9.13±0.57和(11.78±0.71)μmol·L－1(P＜0.05);SBE 1和2 h含藥血清可以顯著增強(qiáng)培養(yǎng)液中SOD活性，分別由LPS對(duì)照組的(2.53±0.13)kU·L－1升高至3.52±0.18和(3.74±0.19)kU·L－1(P＜0.05);SBE 1和2 h含藥血清可以顯著升高培養(yǎng)液中GSH含量，分別由LPS對(duì)照組的(7.1±1.1)mg·L－1升高至8.6±1.6和(9.2±1.7)mg·L－1(P＜0.05)。結(jié)論SBE含藥血清對(duì)LPS刺激的大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞活化具有一定的抑制作用。

黃芩提取物;細(xì)菌脂多糖;一氧化氮;丙二醛;超氧化物歧化酶;谷胱甘肽

黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)系唇形科植物黃芩的干燥根，主要產(chǎn)地為河北、河南、山東、陜西和吉林等地，具有清熱燥濕、瀉火解毒、抑菌、抗炎、止血、安胎和鎮(zhèn)靜等作用［1］。本課題組前期研究表明，黃芩含藥血清可以抑制細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)引起的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系(N9細(xì)胞)的活化［2］，而且此含藥血清對(duì)硝普鈉(sodium nitroprusside)引起的大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元刺激也具有一定的保護(hù)作用［3］。目前，對(duì)黃芩的化學(xué)成分及主要藥理作用已有較多報(bào)道，但關(guān)于其含藥血清對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用尚未見報(bào)道。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫活性細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮核心作用，可被多種物質(zhì)激活［4］。小膠質(zhì)細(xì)胞的激活在阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)發(fā)病中具有重要意義，AD的主要病理特征為皮質(zhì)神經(jīng)元纖維纏結(jié)和神經(jīng)炎性斑的出現(xiàn)及氧化應(yīng)激引起的大量神經(jīng)元的死亡，這些都與小膠質(zhì)細(xì)胞的活化有著密切關(guān)系［5－6］。LPS是一種較強(qiáng)的小膠質(zhì)細(xì)胞刺激劑，體外或體內(nèi)給予LPS均可導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，使其釋放前炎癥細(xì)胞因子和氧化自由基，并導(dǎo)致周圍神經(jīng)元損傷［7－8］。因此，用LPS激活小膠質(zhì)細(xì)胞可以模擬AD患者腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的狀態(tài)，用以評(píng)價(jià)藥物對(duì)AD可能的防治作用［9－12］。本研究ig給予大鼠黃芩提取物(extract of S.baicalensis Georgi，SBE)，給藥后不同時(shí)間制備SBE含藥血清，觀察SBE含藥血清對(duì)LPS刺激的大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中一氧化氮(nitric oxide，NO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性的影響，以期了解黃芩是否能通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞異常激活發(fā)揮對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 藥物

黃芩產(chǎn)自河北圍場(chǎng)，由河北省食品藥品檢驗(yàn)院中藥室鑒定。取黃芩凈藥材，10倍量水煎煮兩次，濃縮至生藥量15倍量體積，濃縮液于80℃調(diào)pH 1.5～2.0，保溫1 h，靜置，離心，沉淀用乙醇研磨均勻，離心，水洗至pH 5～6，干燥即得，黃芩提取率為10.6%。

1.2 動(dòng)物、試劑和儀器

健康成年Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量250～280 g，河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)碼:006160，在自由攝食、飲水環(huán)境中適應(yīng)3～4 d后用于實(shí)驗(yàn)。IMDM高糖干粉培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco-BRL公司;胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，天津TBD生物發(fā)展有限公司;胰蛋白酶，北京經(jīng)科公司;LPS(E.coli O26∶B6)和MTT，美國(guó)Sigma公司;微量MDA含量試劑盒、GSH含量和SOD活性測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所。CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國(guó)NUAIRE;VS-1300L-U型潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;XDS-1B倒置生物顯微鏡，重慶光電儀器總公司;LDZ5-2自動(dòng)平衡離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠;酶標(biāo)儀，奧地利TECAN;重蒸水器，天津泰斯公司;恒溫水浴器，北京長(zhǎng)風(fēng)集團(tuán)公司。

1.3 黃芩含藥血清的制備［13］

按前期整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所得到的SBE最低有效抗炎抗氧化劑量2.5 g·kg－1［14］計(jì)算本研究給藥劑量，參考公式為:給藥劑量=最低有效劑量×培養(yǎng)基內(nèi)血清稀釋度［15］(細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)血清稀釋度為10倍)，計(jì)算得出本研究給藥劑量為25 g·kg－1。取大鼠6只，給藥前眼底靜脈叢取血制備血清，為0 h血清(正常對(duì)照組血清)，然后按10 ml·kg－1ig給藥，2 h后再給藥1次，分別于末次給藥后0.5，1，2，3，4，5和6 h眼底靜脈叢取血，每只0.3 ml。室溫放置1 h，離心，無菌分離并混合血清，56℃水浴中滅活30 min，－20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)［16］

將取得的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元密度調(diào)整為(3～5)×109L－1，按每瓶5～10 m1種植于75 cm2帶螺口帽細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基成分:IMDM培養(yǎng)液，10%FBS，補(bǔ)加抗生素(青霉素100 U·L－1，鏈霉素100 mg·L－1);松蓋靜置培養(yǎng)于CO2培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中，48 h后用等量培養(yǎng)基換液1次以去除死亡細(xì)胞碎片;以后間隔3～4 d換液1次，培養(yǎng)至11～14 d，收集細(xì)胞;將收集得到的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移重新種植于75 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，此時(shí)所得細(xì)胞成分即絕大部分為小膠質(zhì)細(xì)胞。

繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，測(cè)定培養(yǎng)液中NO，MDA和GSH含量及SOD的活性。每樣品設(shè)3個(gè)平行孔。

1.5 細(xì)胞存活率檢測(cè)

用MTT法［17］測(cè)定細(xì)胞存活率。以含10%FBS的IMDM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為3×108L－1，接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μl，于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁培養(yǎng)12 h后，換成無血清的新鮮培養(yǎng)液，穩(wěn)定2 h后加入LPS(終濃度1 mg·L－1)和各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的SBE含藥血清，另設(shè)LPS模型組(不加大鼠血清)和空白對(duì)照組(加入0 h SBE含藥血清)，每孔10 μl。繼續(xù)孵育24 h后加入0.25 g·L－1MTT，每孔10 μl，于37℃下共孵育4 h，吸除培養(yǎng)液后加入等體積的DMSO，室溫振蕩10 min，490 nm測(cè)定其吸光度(A)值。細(xì)胞存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A空白對(duì)照組×100%。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)液中NO，MDA和GSH含量及SOD活性檢測(cè)

細(xì)胞培養(yǎng)和分組同1.5。孵育24 h后采用Griess還原法［18］測(cè)定培養(yǎng)液中NO含量。MDA和GSH含量及SOD活性測(cè)定分別采用微量MDA和GSH含量試劑盒和SOD活性測(cè)定試劑盒進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SBE含藥血清對(duì)LPS刺激的大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響

表1結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，LPS模型組及不同時(shí)間點(diǎn)SBE含藥血清組大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞存活率無明顯變化，表明本研究所用實(shí)驗(yàn)條件對(duì)細(xì)胞存活率無影響。為此，在該實(shí)驗(yàn)條件下探討了SEB含藥血清對(duì)LPS刺激的大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用。

Tab.1 Effect of serum containing extract of S.baicalensis Georgi(SBE)on viability of rat primary microglia cells stimulated with lipopolysaccharide(LPS)

2.2 SBE含藥血清對(duì)LPS刺激大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)NO，MDA和GSH含量及SOD活性的影響

如表2所示，與LPS模型組比較，SBE 0.5，1和2 h的含藥血清可明顯降低培養(yǎng)液中NO含量，其中1 h含藥血清的作用最為明顯;SBE 1，2和3 h的含藥血清明顯降低MDA含量，其中2 h含藥血清的作用最為明顯;SBE 1和2 h的含藥血清明顯升高SOD活性，其中2 h含藥血清的作用最為明顯;SBE 1和2 h的含藥血清明顯增加GSH含量，其中2 h含藥血清的作用最為明顯。

3 討論

中藥血清藥理學(xué)是指將中藥或中藥復(fù)方經(jīng)口給動(dòng)物灌服一定時(shí)間后采集動(dòng)物血液、分離血清，用此含有藥物成分的血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。黃芩是一種傳統(tǒng)的中藥，SBE中往往會(huì)含有多種成分，如果將SBE直接加入到細(xì)胞反應(yīng)體系中，這些成分的一些理化性質(zhì)會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。本研究將SBE ig給予大鼠，然后在不同時(shí)間點(diǎn)制備SBE含藥血清，研究SBE含藥血清對(duì)大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞的影響。相對(duì)來說，這種方法更能反映黃芩整體的藥理學(xué)作用［19］。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫活性細(xì)胞，當(dāng)各種類型腦損傷及腦疾病發(fā)生時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞就會(huì)成為“活化的小膠質(zhì)細(xì)胞”，同時(shí)感染區(qū)內(nèi)細(xì)胞數(shù)量增多?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞可以釋放多種神經(jīng)毒性物質(zhì)［20］，如NO、喹啉酸(可生成神經(jīng)毒性物質(zhì)，使大量組織發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用［21］)、活性氧物質(zhì)、二十碳烯酸類物質(zhì)(其細(xì)胞毒性作用表現(xiàn)為誘發(fā)O2－的釋放及環(huán)氧合酶的活化［22］)和急性期蛋白等等。因此，一些可以用來抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活的藥物顯示了對(duì)AD的預(yù)防及治療作用。

本研究制備LPS誘導(dǎo)的大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞活化模型，模擬AD患者腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的狀態(tài)，觀察了SBE不同時(shí)間點(diǎn)的大鼠含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO，MDA和GSH含量及SOD活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在不影響細(xì)胞存活率的情況下，SBE 0.5，1和2 h的含藥血清可以顯著降低LPS刺激的大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的含量;SBE 1，2和3 h的含藥血清可以顯著降低LPS刺激的大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA的含量;SBE 1和2 h的含藥血清可以顯著升高LPS刺激的大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD的活性;SBE 1和2 h的含藥血清可以顯著升高LPS刺激的大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH的含量。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果從細(xì)胞水平上證明SBE對(duì)LPS刺激引起的大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞的活化具有一定的抑制作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，SBE經(jīng)大鼠體內(nèi)代謝0.5～6 h時(shí)存在不同程度的藥理作用。SBE在體內(nèi)代謝0.5 h時(shí)可發(fā)揮藥理作用;1～2 h時(shí)活性較強(qiáng);4 h后藥理活性基本消失。提示黃芩及其代謝物在體內(nèi)發(fā)揮藥理作用具有一定的時(shí)效關(guān)系。

Tab.2 Effect of serum containing SBE on nitric oxide(NO)，malondialdehyde(MDA)，glutathione(GSH)contents and superoxide dismutase( SOD)activity in medium of rat primary microglia cells stimulated with LPS

本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，SBE含藥血清對(duì)硝普鈉引起大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元刺激有一定的抑制作用，不同時(shí)間點(diǎn)SBE的含藥血清在不影響細(xì)胞存活率的情況下，可不同程度地降低硝普鈉刺激后大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元NO和MDA含量，并不同程度地增加SOD活性［3］。本研究結(jié)果與該研究報(bào)道基本一致，為把黃芩開發(fā)為預(yù)防和治療AD的有效藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Inhibitory effect of serum containing Scutellaria baicalensis Georgi on activity of rat primary microglia cells stimulated by lipopolysaccharide

CUI Xiao-yan，ZHANG Min，DU Zeng-hui，HAN Wen-hua
(Hebei Provincial Institute for Food and Drug Control，Shijiazhuang050011，China)

OBJECTIVETo investigate the protective effect of serum containing extract of Scutellaria baicalensis Georgi(SBE)on the lipopolysaccharide-stimulated activity of primary microglia cells of rats.METHODSThe rats were ig given SBE 25 g·kg－1and blood was taken from retinal venous plexuses within 0.5－6 h and the serum containing SBE was prepared.Then the primary microglia cells from normal rats were incubated with serum containing SBE(10%)and LPS(final concentration 1 mg·L－1)for 24 h.The content of nitric oxide(NO)，malondialdehyde(MDA)，superoxide dismutase(SOD)and glutathione(GSH)in the supernatant was examined with corresponding kits.RESULTSSerum containing SBE markedly decreased the content of NO and MDA in the LPS-stimulated primary rat microglia cells without affecting cell survival.NO content of the LPS model group was(14.2±0.8)μmol·L－1;serum containing SBE within 0.5，1 and 2 h reduced NO content to 12.9±0.6，9.2±0.6 and(9.9±0.4)μmol·L－1(P＜0.05).MDA content of the LPS model group was(13.4±0.7)μmol·L－1;serum containing SBE within 1，2 and 3 h decreased MDA content to 9.4±0.6，9.1±0.6 and(11.8±0.7)μmol·L－1(P＜0.05).Also，serum containing SBE remarkably increased the content of SOD and GSH in the LPS-stimulated primary rat microglia cells without affecting cell survival.SOD activity of the LPS model group was(2.53±0.13)kU·L－1;serum containing SBE within 1 and 2 h increased SOD activity to 3.52±0.18 and(3.74±0.19)kU·L－1(P＜0.05).GSH content of the LPS model group was(7.1±1.1)mg·L－1;serum containing SBE within 1 and 2 h increased GSH content to 8.6±1.6 and(9.2±1.7)g·L－1.CONCLUSIONSerum containing SBE can inhibit the activity of rat primary microglia cells stimulated by lipopolysaccharide.

Scutellaria baicalensis Georgi;lipopolysaccharides;nitric oxide;malondialdehyde;superoxide dismutase;glutathione

CUI Xiao-yan，E-mail:cuijin72696@163.com，Tel:(0311)85212004-8047

R285.5

A

1000-3002(2012)04-0494-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.04.005

崔曉燕(1979－)，沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥理系碩士研究生，主管藥師，主要從事中藥神經(jīng)藥理學(xué)研究。

聯(lián)系作者:崔曉燕，E-mail:cuijin72696@163.com，Tel:(0311)85212004-8047

2011-12-12接受日期:2012-07-17)

(本文編輯:齊春會(huì))