濟(jì)泰片對人肝及Beagle犬肝中美沙酮代謝活性的影響

老東輝，嚴(yán)東明，馬璟

(中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院國家上海新藥安全評價研究中心，上海201203)

濟(jì)泰片對人肝及Beagle犬肝中美沙酮代謝活性的影響

老東輝，嚴(yán)東明，馬璟

(中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院國家上海新藥安全評價研究中心，上海201203)

目的評價濟(jì)泰片對人肝中美沙酮代謝活性潛在的抑制作用及對Beagle犬肝中美沙酮代謝活性潛在的誘導(dǎo)作用。方法在人肝微粒體中加入濟(jì)泰片1.5～150 mg·L－1，CYP3A4抑制劑酮康唑及CYP2D6抑制劑奎尼丁，再加入美沙酮進(jìn)行共孵育30 min。用美沙酮的代謝產(chǎn)物2-亞乙基-1，5-二甲基-3，3-二苯基吡咯烷(EDDP)的生成速率反映美沙酮的代謝活性，評價濟(jì)泰片對美沙酮的抑制作用。Beagle犬ig給予濟(jì)泰片0.1875，0.625和1.875 g·kg－1，每天1次，共36周后制備犬肝微粒體，在制備的犬肝微粒體中加入美沙酮進(jìn)行共孵育30 min，檢測濟(jì)泰片組美沙酮的代謝產(chǎn)物EDDP的生成速率。結(jié)果陽性抑制劑酮康唑、奎尼丁能顯著抑制人肝微粒體中的美沙酮代謝，而濟(jì)泰片未見明顯抑制作用。濟(jì)泰片1.875 g·kg－1組Beagle犬肝微粒體中美沙酮去甲基化反應(yīng)的反應(yīng)速率、代謝能力及單位體質(zhì)量代謝能力均顯著高于正常對照組，分別為0.86±0.17 vs(0.49±0.10)cps·min－1·mg－1蛋白，228±62 vs(115±13)cps·min－1·mg－1蛋白，10.6±0.8 vs(24.4±5.6)cps·min－1·mg－1蛋白·g－1(P＜0.05)。結(jié)論濟(jì)泰片對人肝中美沙酮的代謝不會產(chǎn)生抑制作用。濟(jì)泰片對Beagle犬肝中美沙酮代謝具有一定的誘導(dǎo)作用。

濟(jì)泰片;美沙酮;藥物相互作用;細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)

濟(jì)泰片是根據(jù)明清鄂東四大名醫(yī)之一的楊際泰先生在清道光、同治年間獨(dú)創(chuàng)的戒斷鴉片毒癮的秘方，又在汲取傳統(tǒng)中醫(yī)精髓的基礎(chǔ)上，針對當(dāng)代毒品特性，運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)和工藝流程，研制而成的純中藥戒毒新品。其主要由延胡索、丹參、珍珠粉、人參和洋金花等15味純中藥制成。具有活血行氣、散寒止痛、溫腎健脾、清心安神和解毒制癮之功能［1］。

美沙酮作為替代藥物，最重要的特點(diǎn)是在使用充分劑量時可以減少或消除依賴者對阿片類藥物的渴求;與同類藥物間具有交叉耐受性，使得隨后使用的阿片類藥物的作用降低或不能發(fā)揮作用。因此，在服用美沙酮期間可防止再使用海洛因［2］。美國FDA和麻醉藥品與危險藥品局聯(lián)合于1970年批準(zhǔn)美沙酮維持治療的實驗性治療。FDA于1972年正式批準(zhǔn)美沙酮用于麻醉品依賴治療。

濟(jì)泰片在上市后對其單獨(dú)用藥效果觀察以及中西醫(yī)聯(lián)合用藥方面已有不少研究和報道。如李子紅［3］，熊建國等［4］分別報道了濟(jì)泰片在聯(lián)合美沙酮和洛非西定(lofexidine)用于防復(fù)吸時，可減少西藥用量，療效加強(qiáng)，不良反應(yīng)小等特點(diǎn)。美沙酮維持治療不能過早被打斷。事實上，其目標(biāo)就是針對持續(xù)數(shù)月或數(shù)年的藥癮［5］。兩者均需長期用藥，但其代謝性相互作用尚不明了，不利于臨床用藥安全。因此，有必要評價兩者間代謝性相互作用的可能性。

1 材料與方法

1.1 試劑

鹽酸美沙酮標(biāo)準(zhǔn)品，批號:1009008-1，購自中國藥品生物制品檢定所;濟(jì)泰片粉末，批號:20090416，含量98.42%，由國家上海中藥制劑工程中心提供;人肝微粒體購自XenoTech公司;酮康唑和奎尼丁購自Sigma-Aldrich公司;Pierce BCA蛋白測定試劑盒購自ThermoFisher公司;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)購自TCI公司;三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)購自Amresco公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)購自J.T.Baker公司;氯化鉀、焦磷酸鈉、乙二胺四乙酸和蔗糖購自國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司;甲醇和乙腈購自Merck公司，為色譜純;甲酸購自Tedia公司。

1.2 儀器

液相色譜-質(zhì)聯(lián)用儀(HPLC-MS/MS)(包括Waters Alliance 2695高效液相色譜儀，Premier XE質(zhì)譜儀和MassLynx 4.1軟件)為美國Waters公司產(chǎn)品;ST-16R高速離心機(jī)為美國ThermoFisher公司產(chǎn)品;CP100MX超速離心機(jī)為美國Hitachi公司產(chǎn)品;勻漿機(jī)為IKA公司產(chǎn)品;XW-80C型渦旋混合器為上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠產(chǎn)品;ZHWY-100C氣浴恒溫振蕩培養(yǎng)器為上海智誠分析儀器公司產(chǎn)品。

1.3 溶液的配制

速溶液含KCl 0.1 mol·L－1;勻漿用緩沖液含KCl 0.1 mol·L－1，Tris 0.1 mol·L－1與EDTA 1.0 mmol·L－1，pH 7.4;再次懸浮用緩沖液含焦磷酸鈉0.1 mol·L－1與EDTA 1.0 mmol·L－1，pH 7.25;微粒體儲備用緩沖液含蔗糖0.25 mol·L－1。終止液為含對乙酰氨基酚200 nmol·L－1的乙腈溶液。濟(jì)泰片溶液中含濟(jì)泰片1 g·L－1與Tris-HCl 0.1 mol·L－1。

1.4 HPLC-MS/MS測定方法的建立及美沙酮代謝穩(wěn)定性考察

1.4.1 HPLC-MS/MS測定方法

孵育樣品中美沙酮與其代謝產(chǎn)物EDDP的濃度采用HPLC-MS/MS進(jìn)行分析測定。檢測條件如下:色譜柱為Waters Symmetry C183.5 μm柱，柱溫為40℃。流動相為0.1%甲酸∶乙腈(含0.1%甲酸)，梯度洗脫(0～0.9 min:70∶30，1.0～3.5 min:20∶80，3.6～6 min:70∶30)，流速為0.4 ml·min－1，進(jìn)樣量5 μl。離子化方式選擇電噴霧電離正電子方式。毛細(xì)管電壓為2.7 kV，萃取電壓為2.00 V。干燥氣溫度為300℃，離子源溫度為100℃。干燥氣流速為600 L·h－1，錐孔氣流為50 L·h－1。美沙酮、EDDP和內(nèi)標(biāo)對乙酰氨基酚的質(zhì)譜分析條件見表1。

Tab.1 Parameters of mass spectrometry

1.4.2 美沙酮代謝穩(wěn)定性測定

孵育體系的總體積為0.2 ml。含Tris-HCl緩沖液0.1 mol·L－1(pH 7.4)，人肝微粒體0.5 g·L－1，NADPH 1 mmol·L－1，美沙酮10 μmol·L－1。37℃條件下氣浴孵育30 min后加入200 μl終止液終止反應(yīng)。同時進(jìn)行未經(jīng)孵育，正常對照(不含美沙酮)及陰性對照(不含NADPH)的樣品的處理。

以EDDP峰面積與內(nèi)標(biāo)對乙酰氨基酚峰面積之比求得EDDP的響應(yīng)值，表示美沙酮代謝的程度。

1.5 考察人肝微粒體中濟(jì)泰片對美沙酮去甲基化代謝抑制作用

1.5.1 分組給藥和孵育

孵育體系的總體積為0.2 ml，3份樣品平行處理。含Tris-HCl緩沖液0.1 mol·L－1(pH 7.4)，人肝微粒體0.5 g·L－1，NADPH 1 mmol·L－1，美沙酮10 μmol·L－1，濟(jì)泰片組含濟(jì)泰片1.5，5，15，50和150 mg·L－1。陽性對照組依次含CYP3A4抑制劑酮康唑0.1，0.3，1，3和10 μmol·L－1、CYP2D6抑制劑奎尼丁0.05，0.15，0.5，1.5和5 μmol·L－1以及混合抑制劑酮康唑0.1，0.3，1，3和10 μmol·L－1與奎尼丁0.05，0.15，0.5，1.5和5 μmol·L－1。最終的孵育體系中的乙腈含量為1%(V/V)。

在37℃下預(yù)孵育10 min。加入NADPH后在37℃氣浴中振蕩孵育30 min。在相同的條件下進(jìn)行對照組(不含濟(jì)泰片或NADPH)的孵育。

1.5.2 樣品預(yù)處理及EDDP的測定

孵育30 min后，加入200 μl終止液終止反應(yīng)。渦旋3 min，21 913×g下離心10 min，取上清5 μl進(jìn)樣分析EDDP含量。

1.5.3 濟(jì)泰片對美沙酮代謝抑制作用的測定

人肝微粒體中美沙酮去甲基化代謝的剩余反應(yīng)活性以不同濃度的抑制劑(濟(jì)泰片或各陽性對照)存在條件下代謝產(chǎn)物EDDP的生成速率相對于對照(無濟(jì)泰片)中EDDP的生成速率的百分比來表示。使用GraphPad Prism 5進(jìn)行非線性擬合，并計算IC50。

1.6 考察犬體內(nèi)濟(jì)泰片對美沙酮去甲基化代謝誘導(dǎo)作用

1.6.1 動物的分組、給藥及處理

Beagle犬分別ig給予濟(jì)泰片0.1875，0.625及1.875 g·kg－1(分別相當(dāng)于臨床人每日最大用量0.245 g·kg－1的3，10和30倍)，每組4只，雌雄各半。每周連續(xù)給藥6 d，每天1次，共6 d，周日停藥1 d，連續(xù)ig給藥36周。給藥容量為7 ml·kg－1。正常對照組ig給予去離子水。給藥結(jié)束后處死犬，取肝。記錄各組Beagle犬體質(zhì)量并計算肝系數(shù)=肝質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)×100。

1.6.2 Beagle犬肝微粒體的制備及蛋白濃度測定

將取得的Beagle犬肝組織在碎冰上剪碎。每份肝組織在冰上加入勻漿用緩沖液勻漿后使用勻漿機(jī)制備肝勻漿。所得的肝勻漿9000×g離心25 min。收集上清液，棄去底部沉淀物。上清液，105 000×g離心70 min，棄去上清液，加入再次懸浮用緩沖液重懸浮后105 000×g離心45 min。棄去上清液獲得最終沉淀物為制備得到的犬肝微粒體。加入預(yù)冷的微粒體儲備用緩沖液，并用勻漿機(jī)重新懸浮微粒體，在－70℃冰箱中保存［6］。使用Pierce BCA試劑盒測定制備得的Beagle犬肝微粒體蛋白濃度［7］。

1.6.3 樣品孵育及預(yù)處理

孵育體系的總體積為0.2 ml，2份樣品平行處理。含Tris-HCl緩沖液0.1 mol·L－1(pH 7.4)，犬肝微粒體終濃度均至0.5 g·L－1，NADPH 1 mmol·L－1和美沙酮10 μmol·L－1。最終的孵育體系中的乙腈含量為1%(V/V)。在37℃下預(yù)孵育10 min。加入NADPH后在37℃氣浴中振蕩孵育30 min。30 min后，加入200 μl終止液終止反應(yīng)。渦旋3 min，21 913×g下離心10 min，取上清5 μl進(jìn)樣分析EDDP含量。

1.6.4 美沙酮去甲基化代謝能力的計算

以EDDP的生成速率，個體動物的代謝能力(代謝能力=生成速率×肝質(zhì)量)及單位體質(zhì)量的代謝能力(單位體質(zhì)量的代謝能力=生成速率×肝質(zhì)量/體質(zhì)量)來評價在犬中美沙酮去甲基化代謝的反應(yīng)活性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 美沙酮的代謝穩(wěn)定性

美沙酮代謝穩(wěn)定性結(jié)果見圖1。在孵育30 min后，樣品中2.3 min處出現(xiàn)一個未知峰，而空白對照、陰性對照及孵育0 min樣品在該時間均見峰。說明該峰為美沙酮的代謝產(chǎn)物。其離子對質(zhì)荷比為278.00→248.90。與參考文獻(xiàn)［8］報道一致，可初步推測該代謝產(chǎn)物為EDDP。

Fig.1 Metabolic stability of methadone and its metabolite EDDP.A:blank，B:negative control(without NADPH)，C:sample incubated for 0 min，D:sample incubated for 30 min.1.metabolite EDDP;2.methadone;3.internal standard:acetaminophen.

2.2 濟(jì)泰片對美沙酮去甲基化代謝抑制作用

加入濟(jì)泰片、酮康唑、奎尼丁、酮康唑與奎尼丁后的美沙酮去甲基化反應(yīng)的剩余活性見圖2。濟(jì)泰片組美沙酮去甲基化反應(yīng)的活性未見顯著抑制;而各陽性對照(酮康唑，奎尼丁，酮康唑+奎尼丁)均發(fā)生顯著抑制。陽性對照中酮康唑的IC50為1.52 μmol·L－1;奎尼丁的IC50為12.41 μmol·L－1;酮康唑+奎尼丁組的IC50為0.83 μmol·L－1(以酮康唑計)與1.65 μmol·L－1(以奎尼丁計)。

Fig.2 Inhibition of Jitai tablets(JTP)，quinidine and ketoconazole on methadone demethylation.±s，n=3.

2.3 濟(jì)泰片對美沙酮去甲基化代謝的誘導(dǎo)作用

2.3.1 Beagle犬肝微粒體的蛋白濃度

Beagle犬的肝質(zhì)量、肝系數(shù)以及使用BCA法測得的Beagle犬肝微粒體蛋白濃度如表2所示。濟(jì)泰片0.1875，0.625和1.875 g·kg－1組肝質(zhì)量及蛋白濃度與溶媒對照組相比無顯著性差異。濟(jì)泰片1.875 g·kg－1組肝系數(shù)為溶媒對照組的129%，顯著大于溶媒對照組(P＜0.05);濟(jì)泰片0.1875和0.625 g·kg－1組與溶媒對照組相比均有增大的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異。

Tab.2 Effect of JTP on liver mass，liver index and protein concentration in Beagle dog liver microsome with methadone

2.3.2 濟(jì)泰片對美沙酮去甲基化代謝的誘導(dǎo)作用

表3為濟(jì)泰片0.1875，0.625和1.875 g·kg－1組Beagle犬微粒體中美沙酮代謝產(chǎn)物EDDP的生成速率;以及溶媒對照組、濟(jì)泰片0.1875，0.625和1.875 g·kg－1組Beagle犬微粒體中美沙酮去甲基化反應(yīng)的代謝速率、代謝能力及單位體質(zhì)量代謝能力。與正常對照組相比，濟(jì)泰片1.875 g·kg－1組的生成速率、代謝速率明顯降低(P＜0.05)。

JTP 0.1875和0.625 g·kg－1組中美沙酮去甲基化反應(yīng)的反應(yīng)速率、代謝能力與單位體質(zhì)量代謝能力分別為溶媒對照組的110%和128%，102%和132%，133%和162%，與溶劑對照組相比并未見顯著性差異;而JTP 1.875 g·kg－1組中美沙酮去甲基化反應(yīng)的反應(yīng)速率、代謝能力與單位體質(zhì)量代謝能力分別為溶媒對照組的175%，198%與230%，與溶劑對照組相比均顯著增大(P＜0.05)。誘導(dǎo)作用、代謝能力與單位體質(zhì)量代謝能力均表現(xiàn)出了一定的劑量依賴性。

濟(jì)泰片體外實驗中對人肝中美沙酮去甲基化代謝未觀察到抑制作用，故濟(jì)泰片在臨床上與一線戒毒藥美沙酮合用時不太可能發(fā)生基于CYP450的代謝性抑制作用。Beagle犬連續(xù)給予濟(jì)泰片1.875 g·kg－1(相當(dāng)于臨床每日最大劑量的30倍)36周后，能夠誘導(dǎo)其肝微粒體中的美沙酮去甲基化反應(yīng)。但是否會發(fā)生具有臨床意義的誘導(dǎo)作用有待進(jìn)一步研究。

Tab.3 Effect of JTP on metabolic rate，metabolic ability and metabolic ability per body mass(BM)of methadone demethylation

3 討論

有大量報道植物藥制劑對藥酶活性產(chǎn)生影響［9］，說明中藥也可能對藥酶活性有影響。中藥抑制性藥物相互作用研究，通常采用人肝微粒體體系進(jìn)行實驗以確定抑制性相互作用是否會發(fā)生［10－11］。有關(guān)中藥誘導(dǎo)性藥物相互作用的報道較少，主要利用肝細(xì)胞體系進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)實驗，也有通過測定mRNA的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行研究［12－13］。本研究使用HPLC-MS/MS進(jìn)行檢測，靈敏度高，分析速度快，易排除中藥復(fù)雜組分中的干擾，適用于中藥相互作用的研究。本研究中抑制作用研究采用體外人肝微粒體系統(tǒng)，實驗操作簡便快速，結(jié)果無需跨種屬外推;誘導(dǎo)作用研究以制備長期給藥后Beagle犬的肝微粒體作為實驗體系，能夠反映出整體水平下的酶活性改變情況。

文獻(xiàn)報道美沙酮主要通過CYP3A4與CYP2D6催化的N-去甲基化反應(yīng)代謝。CYP2C18也參與美沙酮的代謝，但并非美沙酮在人體中的主要代謝途徑［14］。本研究采用CYP2D6與CYP3A4抑制劑奎尼丁與酮康唑作為陽性對照，以驗證實驗系統(tǒng)［15］。盡管美沙酮代謝途徑多，但其主要代謝產(chǎn)物均為EDDP。故本研究中以EDDP的生成情況來評價美沙酮的代謝情況。

根據(jù)文獻(xiàn)報道，肝微粒體所占肝質(zhì)量比例為52.5 mg·g－1［16］，而肝質(zhì)量占體質(zhì)量的比例為20 g·kg－1［17］。故按體質(zhì)量計算肝微粒體應(yīng)為1 g·kg－1。濟(jì)泰片在肝微粒體中能達(dá)到的最高濃度為30 mg·g－1肝微粒體。濟(jì)泰片200 mg·kg－1，假設(shè)其生物利用度為100%并完全分布至肝中，則濟(jì)泰片在肝中所能達(dá)到的最高暴露量為30 mg·g－1肝微粒體。本研究中肝微粒體濃度為0.5 g·L－1，濟(jì)泰片的濃度設(shè)為1.5～150 mg·L－1，該范圍能夠涵蓋體內(nèi)可能達(dá)到的最大濃度。一般評價抑制的研究需要有明確的指標(biāo)成分及該成分在體內(nèi)的吸收情況，本實驗在無此類信息的前提下做出上述幾個假設(shè)，能夠確保抑制實驗不會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。美沙酮的有效阻斷渴求與防治出現(xiàn)戒斷癥狀的體內(nèi)濃度為150～200 μg·L－1［18］，故本研究中誘導(dǎo)研究中美沙酮的終濃度設(shè)為1 μmol·L－1(約345.9 μg·L－1)，與人體內(nèi)可能達(dá)到的實際濃度相當(dāng)。

本研究濟(jì)泰片150 mg·L－1濃度下對美沙酮在人肝微粒體中的代謝無抑制作用，故在體內(nèi)也不會產(chǎn)生相應(yīng)的抑制作用。濟(jì)泰片0.1875～1.875 g·kg－1(相當(dāng)于臨床最大給藥量的3～30倍)時，Beagle犬肝微粒體中顯示對美沙酮代謝有一定的劑量依賴性的誘導(dǎo)作用。濟(jì)泰片在Beagle犬中低劑量組中給藥劑量為0.1875 g·kg－1(相當(dāng)于臨床最大人用劑量的3倍)，給藥36周后并未觀察到對美沙酮去甲基化代謝反應(yīng)產(chǎn)生誘導(dǎo)性相互作用。故臨床按照說明書服用，不會發(fā)生美沙酮去甲基化代謝相關(guān)的藥物相互作用。因此濟(jì)泰片同美沙酮合用時不會引起美沙酮的不良反應(yīng)，長期服用濟(jì)泰片也不會降低美沙酮藥效。

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Effect of Jitai tablets on metabolic activity of methadone in human and Beagle dog livers

LAO Dong-hui，YAN Dong-ming，MA Jing
(Naitonal Shanghai Center for Drug Safety Evaluation and Research，Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry，Chinese Institute of Pharmacetuical Industry，Shanghai201203，China)

OBJECTIVETo evaluate metabolic inhibition potential of Jitai tablet(JTP)on methadone in human liver and induction potential in Beagle dog liver for predicting drug-drug interactions while coadministrating.METHODSJTP 1.5－150 mg·L－1，positive inhibitors of CYP3A4 ketoconazole and positive inhibitor of CYP2D6 quinidine were added into human liver microsome(HLM)incubation system with methadone for coincubation.Formation rate of EDDP(a metabolite of methadone)indicated metabolic activity on methadone for inhibition evaluation.After Beagle dogs were administered by JTP 0，0.1875，0.625 and 1.875 g·kg－1for 36 weeks，dog liver microsome(DLM)was prepared.Methadone was added in DLM incubation system.EDDP formation rate and metabolic ability in JTP groups were determined for induction evaluation of JTP on methadone.RESULTSSignificant inhibitory effect on methadone demethylation was found in ketoconazole，quinidine，and ketoconazole+quinidine groups，but there was no inhibitory effect in JTP group.The metabolic rate，metabolic ability and metabolic ability per body mass of methadone demethylation in JTP 1.875 g·kg－1group were greater than those in normal control group，and were 0.86±0.17 vs(0.49±0.10)cps·min－1·mg－1protein，228±62 vs(115±13)cps·min－1·mg－1protein，10.6±0.8 vs(24.4±5.6)cps·min－1·mg－1protein·g－1，respectively(P＜0.05).CONCLUSIONJTP has no inhibitory effect on methadone metabolism in human liver.JTP shows certain inductive effect on methadone metabolism in DLM.

Jitai tablet;methadone;drug interactions;cytochrome P-450 enzyme system

The project supported by National Science and Technology Support Program(2008BAI49B05);and Major Projects Foundation of National Science and Technology of China(2012ZX09302002)

YAN Dong-ming，E-mail:dmyan@ncdser.com，Tel:50800333-305

R969.2

A

1000-3002(2012)06-0876-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.06.017

國家科技支撐計劃項目(2008BAI49B05);十二五國家科技重大專項(2012ZX09302002)

老東輝(1982－)，男，碩士研究生，主要從事毒物代謝動力學(xué)與藥物相互作用的研究;嚴(yán)東明(1982－)，男，博士，助理研究員，主要從事藥代動力學(xué)研究。

嚴(yán)東明，E-mail:dmyan@ncdser.com

2012-02-17接受日期:2012-06-27)

(本文編輯:付良青)