基于胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮u(píng)價(jià)黃芩苷的胚胎毒性

張崴，宋殿榮，王雅楠，朱澤

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科，天津300150;2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193;3.天津醫(yī)科大學(xué)微生物教研室，天津300070)

基于胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮u(píng)價(jià)黃芩苷的胚胎毒性

張崴1，2，宋殿榮1，王雅楠1，朱澤3

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科，天津300150;2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193;3.天津醫(yī)科大學(xué)微生物教研室，天津300070)

目的應(yīng)用胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ腕w系評(píng)價(jià)黃芩苷的胚胎毒性。方法分別將胚胎干細(xì)胞D3和胚胎成纖維細(xì)胞(BALB/c 3T3)與黃芩苷20，40，60，80和100 mg·L－1共培養(yǎng)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，分別計(jì)算黃芩苷對(duì)胚胎干細(xì)胞D3和3T3細(xì)胞增殖半數(shù)抑制濃度IC50(D3)和IC50(3T3)。利用懸滴-懸浮-貼壁方法，體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)心肌細(xì)胞特異表達(dá)肌球蛋白重鏈(β-MHC)基因的表達(dá)，計(jì)算胚胎干細(xì)胞D3定向分化半數(shù)抑制濃度，即ID50(D3)。利用胚胎毒性統(tǒng)計(jì)公式，預(yù)測(cè)黃芩苷的胚胎毒性。結(jié)果不同濃度黃芩苷作用10 d后，胚胎干細(xì)胞D3和3T3細(xì)胞存活能力隨著黃芩苷濃度增加緩慢下降，黃芩苷對(duì)胚胎干細(xì)胞D3和3T3細(xì)胞增殖均有一定程度的抑制作用，其IC50(D3)和IC50(3T3)分別為135.9和63.3 mg·L－1。體外胚胎干細(xì)胞經(jīng)懸滴-懸浮-貼壁培養(yǎng)可分化為能夠表達(dá)β-MHC基因的心肌樣細(xì)胞，黃芩苷2，5，10，20和40 mg·L－1對(duì)胚胎干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞的抑制率分別為29.5%，46.8%，59.6%，61.7%和69.0%，黃芩苷對(duì)胚胎干細(xì)胞分化有一定程度的抑制作用，其體外心肌細(xì)胞定向分化的ID50(D3)為7.25 mg·L－1。根據(jù)胚胎毒性計(jì)算公式，計(jì)算得黃芩苷具有弱胚胎毒性。結(jié)論黃芩苷具有弱胚胎毒性。

胚胎干細(xì)胞;黃芩苷;毒性作用

黃芩苷(baicalin，C21H18O11)是從唇形科植物黃芩干燥根中提取的一種黃酮類(lèi)化合物，相對(duì)分子質(zhì)量為446.36，極性小，具有抑菌抗炎、抗病毒、抗腫瘤、心血管保護(hù)作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗過(guò)敏反應(yīng)和保護(hù)肝等藥理作用［1］，但是對(duì)其胚胎毒性的研究未見(jiàn)報(bào)道。宋殿榮等［2］發(fā)現(xiàn)，妊娠期應(yīng)用雙黃連凍干粉透過(guò)胎盤(pán)屏障造成胎兒宮內(nèi)暴露的主要藥物成分為黃芩苷，因此，研究黃芩苷的胚胎毒性對(duì)科學(xué)準(zhǔn)確評(píng)價(jià)妊娠期應(yīng)用雙黃連凍干粉的安全性有重要意義。本研究應(yīng)用胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESC)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑫r(shí)采用ES-D3和BALB/c-3T3細(xì)胞系對(duì)黃芩苷的胚胎毒性進(jìn)行初步預(yù)測(cè)，其中D3代表胚胎組織，用于評(píng)價(jià)受試物作用后干細(xì)胞分化成為心肌細(xì)胞的能力。3T3代表成體組織，用于比較分析受試物作用后體細(xì)胞的存活能力。以進(jìn)一步評(píng)價(jià)雙黃連凍干粉的胚胎毒性，為臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和動(dòng)物

胚胎干細(xì)胞D3(ES-D3)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。胚胎成纖維細(xì)胞(BALB/c 3T3)，由天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院研究所惠贈(zèng)。BALB/c小鼠，SPF級(jí)，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK-(軍)2007-004。

1.2 試劑和儀器

黃芩苷購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110715-200815。knock out-DMEM培養(yǎng)基、knock out-血清替代品、1%非必需氨基酸、β-巰基乙醇、谷氨酰胺和胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司。胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司。鼠白血病抑制因子1000 kU·L－1購(gòu)自Chemicon公司。二甲亞砜、明膠、5-氟尿嘧啶、噻唑藍(lán)和絲裂霉素購(gòu)自Sigma公司。IX51型倒置顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品、Σ960酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀和Chromo4四通道實(shí)時(shí)定量PCR儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 飼養(yǎng)層細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)制備

BALB/c小鼠，孕期12.5～14.5 d，頸椎脫臼處死，浸泡、洗刷，消毒，剖腹取出胚胎，去除頭、肝和四肢，培養(yǎng)液沖洗，充分剪碎。加入10 ml 0.25%胰酶-0.04%EDTA，分階段消化，吸取上層懸液并離心收集細(xì)胞，接種于T75培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察胚胎成纖維細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底，加入絲裂霉素10 mg·L－1混勻，培養(yǎng)4 h，消化，接種于明膠化的培養(yǎng)皿中備用。

1.4 小鼠胚胎干細(xì)胞D3培養(yǎng)

從液氮中取出1支ES-D3復(fù)蘇，接種于已鋪好胚胎成纖維細(xì)胞的6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每天更換細(xì)胞培養(yǎng)液(高糖DMEM培養(yǎng)基，15%胎牛血清，谷氨酰胺2 mmol·L－1，1%非必需氨基酸，β-巰基乙酸0.1 mmol·L－1，青霉素50 kU·L－1，鏈霉素50 mg·L－1，鼠白血病抑制因子1000 kU·L－1)。ES增殖3 d，形成大小均一的克隆，細(xì)胞克隆鋪占60%～70%時(shí)傳代。

1.5 MTT法檢測(cè)黃芩苷對(duì)胚胎干細(xì)胞D3和3T3細(xì)胞毒性

將ES細(xì)胞2.5×106L－1的接種于96孔板上，每孔分別加入含黃芩苷50，75，100，125和150 mg·L－1的ES細(xì)胞完全培養(yǎng)液。將3T3細(xì)胞2.5×106L－1接種于96孔板上，每孔分別加入含黃芩苷20，40，60，80和100 mg·L－1的3T3細(xì)胞培養(yǎng)液(高糖DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，谷氨酰胺2 mmol·L－1，青霉素50 kU·L－1，鏈霉素50 mg·L－1)。設(shè)立空白對(duì)照組。第3天，第5天更換培養(yǎng)液。第10天相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。于波長(zhǎng)570 nm處檢測(cè)吸光度(A570nm)，計(jì)算不同濃度黃芩苷對(duì)ES細(xì)胞和3T3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率(inhibitory rate，IR)，IR=〔(A對(duì)照－A實(shí)驗(yàn))/A對(duì)照〕×100%［3］。分別以黃芩苷濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制濃度-反應(yīng)曲線，應(yīng)用GraphPadPrism5軟件計(jì)算50%的ES-D3細(xì)胞和3T3細(xì)胞增殖受抑制的黃芩苷濃度，即半數(shù)抑制濃度(50%inhibitory concentration，IC50)，其中對(duì)ES-D3細(xì)胞活性半數(shù)抑制濃度以IC50(D3)表示，對(duì)3T3細(xì)胞活性的半數(shù)抑制濃度以IC50(3T3)表示。

1.6 黃芩苷抑制胚胎干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞能力的檢測(cè)

1.6.1 胚胎干細(xì)胞體外分化培養(yǎng)

①懸滴培養(yǎng):ES細(xì)胞中加入含黃芩苷2，5，10，20和40 mg·L－1的分化培養(yǎng)液(高糖DMEM培養(yǎng)基，15%胎牛血清，谷氨酰胺2 mmol·L－1，1%非必需氨基酸，β-巰基乙酸0.1 mmol·L－1，青霉素50 kU·L－1，鏈霉素50 mg·L－1)，調(diào)整細(xì)胞密度至3.75×104L－1。設(shè)立空白對(duì)照組和5-氟尿嘧啶為陽(yáng)性對(duì)照組。分別將單細(xì)胞懸液置于6 cm細(xì)菌培養(yǎng)皿中，從中取單細(xì)胞懸液以每滴20 μl，培養(yǎng)皿每皿80滴置于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)蓋上。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿蓋子至正常位置，蓋在培養(yǎng)皿上，使之懸滴生長(zhǎng)，培養(yǎng)皿內(nèi)加入5 ml PBS。置37℃，5%CO2和飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。②懸浮培養(yǎng):第3天于倒置顯微鏡下觀察，每個(gè)懸滴內(nèi)均含有1個(gè)擬胚體。吸棄PBS，分別加入上述不同濃度黃芩苷分化培養(yǎng)液。將擬胚體沖入培養(yǎng)皿底，并移至6 cm細(xì)菌培養(yǎng)皿懸浮培養(yǎng)2 d。③貼壁培養(yǎng):第5天時(shí)肉眼觀察每個(gè)培養(yǎng)皿中均可見(jiàn)數(shù)十個(gè)擬胚體。分別接種至事先用明膠包被的24孔板內(nèi)，每孔中加入2 ml上述不同濃度黃芩苷分化培養(yǎng)液。37℃，5%CO2和飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d。

1.6.2 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)分化心肌細(xì)胞特異基因(β-MHC)mRNA的表達(dá)

Trizol試劑一步法提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)總RNA濃度，鑒定其純度及完整性，以2 μg RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。心肌分化特異基因肌球蛋白重鏈(β-MHC)引物序列正向:5'-GCCCCTCCTCACATCTTCTCC-3'和反向:5'-CAGGGTTGGCTTGGATGATTT-3';內(nèi)參照GAPDH引物序列正向:5'-CCTTCCGTGTTCCTACCC-3'和反向:5'-CAACCTGGTCCTCAGTGTAG-3'。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:SYBR Green Realtime PCR Master Mix 12.5 μl，樣品溶液2.5 μl，引物各1.0 μl，加雙蒸水至總體積25 μl。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性60 s;95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，熔解曲線72℃to 95℃，每0.4℃讀數(shù)1次，持續(xù)1 s。用ABI 7500 Software v2.0系統(tǒng)對(duì)擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，生成定量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，計(jì)算機(jī)分析Ct值。按照2－△△Ct法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。β-MHC表達(dá)量=2－△△Ct，其中△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)－△Ct對(duì)照，△Ct=Ctβ-MHC－CtGAPDH。利用心肌細(xì)胞特異基因β-MHC的表達(dá)量，計(jì)算黃芩苷對(duì)ES細(xì)胞分化的抑制率，抑制率(%)=〔(β-MHC對(duì)照-β-MHC實(shí)驗(yàn))/β-MHC對(duì)照〕×100%。以黃芩苷濃度為橫軸，抑制率為縱軸，繪制濃度-反應(yīng)曲線。計(jì)算50%的ES細(xì)胞分化受抑制的黃芩苷濃度，即ID50(D3)。

1.7 黃芩苷胚胎毒性分析

根據(jù)Scholz等［4］的報(bào)道，評(píng)價(jià)胚胎毒性計(jì)算公式Ⅰ:5.916lg〔IC50(3T3)〕+3.500×lg〔IC50(D3)〕－5.307〔IC50(3T3)－ID50(D3)〕/IC50(3T3)－15.72。公式Ⅱ:3.651lg〔IC50(3T3)〕+2.394×lg〔IC50(D3)〕－2.033〔(IC50(3T3)－ID50(D3)/IC50(3T3)〕－6.85。公式Ⅲ:－0.125 lg〔IC50(3T3)〕+1.917×lg〔IC50(D3)〕+1.500×〔IC50(3T3)－ID50(D3)〕/IC50(3T3)－2.67。公式中均以mg·L－1為單位，其中IC50(D3)和IC50(3T3)分別為ES D3細(xì)胞和3T3細(xì)胞增殖半數(shù)濃度，ID50(D3)為ES細(xì)胞體外定向分化為心肌細(xì)胞半數(shù)抑制濃度。

評(píng)價(jià)胚胎毒性判定標(biāo)準(zhǔn)為:若上述結(jié)果中，公式Ⅰ值＞公式Ⅱ值且公式Ⅰ值＞公式Ⅲ值，則受試物胚胎毒性為一級(jí)，即判定黃芩苷無(wú)胚胎毒性;若公式Ⅱ值＞公式Ⅰ值且公式Ⅱ值＞公式Ⅲ值，則判定黃芩苷胚胎毒性為二級(jí)，即弱胚胎毒性;若公式Ⅲ值＞公式Ⅰ值且公式Ⅲ值＞公式Ⅱ值，則判定黃芩苷胚胎毒性為三級(jí)，即強(qiáng)胚胎毒性。

利用胚胎毒性計(jì)算公式和判定標(biāo)準(zhǔn)，分析黃芩苷的胚胎毒性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷對(duì)細(xì)胞存活的影響

如圖1濃度-反應(yīng)曲線所示，黃芩苷不同濃度作用10 d后，胚胎干細(xì)胞D3和BALB/c 3T3細(xì)胞存活能力，隨著黃芩苷濃度增加緩慢下降，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴(lài)性，經(jīng)計(jì)算IC50(D3)為135.9 mg·L－1，IC50(3T3)為63.34 mg·L－1。表明黃芩苷對(duì)ES細(xì)胞和3T3細(xì)胞增殖均有一定程度的抑制作用，但是抑制程度較弱。

Fig.1 Effect of baicalin on ES cells(A)and 3T3 cells(B)proliferation.The embryonic stem or Balb/c 3T3 cells were seeded in the 96 hole on the board.Each hole was respectively added with different concentration of Baicalin in ES cells complete culture solution.Medium replace on the third and fifth days，and MTT assay used for the detection of cell activity in the 570 nm wavelength on the tenth day(A570nm).±s，n=5.Inhibitory rate(%)=〔A570nm(blank control)－A570nm(experimental)〕/A570nm(blank control)×100%

2.2 黃芩苷對(duì)ES細(xì)胞向心肌分化的影響

體外ES細(xì)胞經(jīng)懸滴培養(yǎng)3 d、懸浮培養(yǎng)2 d和貼壁培養(yǎng)5 d后可分化為能夠表達(dá)β-MHC基因的心肌樣細(xì)胞(圖2)，第3天可見(jiàn)形成的擬胚體周邊緣光滑，形態(tài)正圓、勻一(圖2A);第5天可見(jiàn)擬胚體開(kāi)始分化，細(xì)胞分成葉狀，體積逐漸增大(圖2B);第10天可見(jiàn)擬胚胎分化成心肌細(xì)胞(圖2C)。由實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)心肌β-MHC表達(dá)的擴(kuò)增曲線和熔解曲線見(jiàn)(圖3)可見(jiàn)，隨著黃芩苷作用濃度的增加，ES細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞的能力逐漸下降(表1)，可見(jiàn)黃芩苷對(duì)ES細(xì)胞分化有一定程度的抑制作用。根據(jù)濃度-反應(yīng)曲線，計(jì)算ID50(D3)為7.25 mg·L－1。

Fig.2 Effect of baicalin on ES cells differentiation toward cardiomyocytes.(A，B:×200，C:×100).Baicalin was added into cultured embryonic stem cells，after hanging drop cultured for 3 d，to form embryoid bodies，the embryoid bodies were placed in Petri dishes，cultured 2 d，and then inoculated to gelatin coated 24 hole plate，adherent cultured 5 d.A:on the 3rd day;B:on the 5th day;C:on the 10th day.

Fig.3 Effect of baicalin on embryonic stem cell differentiation into cardiomyocyte cells with myosin heavy chain expression.Embryonic stem cells were cultured with different concentrations of baicalin by hanging drop-suspension-adherent for 10 d，and then the real-time quantitative PCR assay was used to detect expression of heart muscle myosin heavy chain(β-MHC)gene and housekeeping genes glyceraldehyde dehydrogenase(GAPDH).A:melting curve of β-MHC gene;B:amplification curve of β-MHC gene.

Tab.1 Effect of baicalin on embryonic cell differentiated into myocardial cells influence

2.3 黃芩苷胚胎毒性預(yù)測(cè)

分別將IC50(D3)，IC50(3T3)和ID50(D3)結(jié)果，按照胚胎毒性評(píng)價(jià)公式計(jì)算，公式Ⅰ結(jié)果為－2.295，公式Ⅱ結(jié)果為3.035，公式Ⅲ結(jié)果為2.522，公式Ⅱ＞公式Ⅰ，而且公式Ⅱ＞公式Ⅲ。根據(jù)胚胎毒性判定標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)測(cè)黃芩苷具有弱胚胎毒性。

3 討論

胚胎毒性研究方法包括體內(nèi)生殖發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)和體外替代實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)生殖發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)即三階段實(shí)驗(yàn):①生育力與早期胚胎發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn);②胚胎-胎仔發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)(致畸敏感期生殖毒性實(shí)驗(yàn));③圍生期毒性實(shí)驗(yàn)。這一實(shí)驗(yàn)需要使用大量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、費(fèi)用較高、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、難以迅速對(duì)大量物質(zhì)進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)。因此，發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)的體外可替代模型日益受到關(guān)注。體外替代實(shí)驗(yàn)主要有體外全胚胎培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、胚胎細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(embryonic stem cell test，EST)［5］。其中EST是目前唯一一個(gè)利用細(xì)胞系、而非懷孕動(dòng)物的體外替代實(shí)驗(yàn)。胚胎干細(xì)胞來(lái)源于早期胚胎，它在體外既可維持不分化而無(wú)限增殖，又能參與胚胎發(fā)育，它可以在不同的誘導(dǎo)條件下向特定的組織器官分化。根據(jù)ESC的特性發(fā)展起來(lái)的EST可以從細(xì)胞毒性、分化抑制以及分子生物學(xué)水平反映發(fā)育毒性，具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、實(shí)驗(yàn)周期短、實(shí)驗(yàn)條件可控、劑量-反應(yīng)關(guān)系易測(cè)、排除母體干擾等優(yōu)點(diǎn)，于2006年被歐洲替代方法認(rèn)證中心接受，成為體外藥物和化合物胚胎毒性篩選的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法。Scholz等［6］研究EST能對(duì)大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)的胚胎毒性進(jìn)行正確分類(lèi)預(yù)測(cè)，且與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較好的一致性，其準(zhǔn)確性可達(dá)78%。在本研究中，同時(shí)應(yīng)用了ES-D3和BALB/c-3T3兩種細(xì)胞系來(lái)檢測(cè)黃芩苷的毒性。其中D3代表胚胎組織，用于評(píng)價(jià)受試物作用后干細(xì)胞分化成為心肌細(xì)胞的能力。選擇心肌細(xì)胞作為分化發(fā)育后的衡量指標(biāo)，一方面是先天性心臟缺陷往往伴有其他組織器官的發(fā)育缺陷，因而心肌細(xì)胞損害可以作為胚胎損傷的早期預(yù)警指示，另一方面是心肌細(xì)胞的作用與竇房結(jié)、心房、心室的完整功能相似，能夠反映整個(gè)組織的發(fā)育特點(diǎn)［7－8］。3T3代表成體組織，用于比較分析受試物作用后體細(xì)胞的存活能力。盡管ES細(xì)胞在體外的分化途徑和機(jī)制與體內(nèi)胚胎細(xì)胞的分化途徑和機(jī)制不完全相同，但在分子水平上有許多相似之處，而且不同哺乳動(dòng)物種屬著床前胚胎發(fā)育形態(tài)學(xué)及某些生化參數(shù)極其相似，這些均為EST預(yù)測(cè)藥物胚胎毒性提供了理論基礎(chǔ)。

中藥具有作用整體性、組成成分多樣性和可變性、作用靶點(diǎn)和機(jī)制復(fù)雜性、以及成分間相互作用難以預(yù)測(cè)性的特點(diǎn)［9］，應(yīng)用中藥后只有被吸收入血或是在體內(nèi)代謝最終存在于血液中含量較高的成分，才是發(fā)揮藥效或毒性作用的成分。妊娠期應(yīng)用中藥，母體內(nèi)藥物成分只有透過(guò)胎盤(pán)屏障，進(jìn)入胎兒體內(nèi)才可能對(duì)胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育造成影響。胎盤(pán)作為母體與胎兒之間的重要器官，具有物質(zhì)交換、代謝、防御以及合成功能。胎盤(pán)內(nèi)存在母體和胎兒兩個(gè)血液循環(huán)系統(tǒng)，母體動(dòng)脈血從子宮螺旋動(dòng)脈流入絨毛間隙，胎兒的靜脈血經(jīng)臍動(dòng)脈流入絨毛毛細(xì)血管，與絨毛間隙內(nèi)的母體血進(jìn)行物質(zhì)交換后，成為動(dòng)脈血，經(jīng)臍靜脈回流到胎兒，兩者的血液在各自封閉管道內(nèi)循環(huán)，互不相混，形成胎盤(pán)屏障，具有保護(hù)胎兒的作用。藥物能否通過(guò)胎盤(pán)屏障除了胎盤(pán)因素外，藥物因素也十分重要，與藥物的相對(duì)分子質(zhì)量、極性、脂溶性和血漿蛋白結(jié)合率有關(guān)。分子質(zhì)量小于500、極性小、脂溶性高、血漿蛋白結(jié)合率低的藥物較容易透過(guò)胎盤(pán)屏障。本研究應(yīng)用EST預(yù)測(cè)了黃芩苷的胚胎毒性，結(jié)果顯示其具有弱胚胎毒性，為進(jìn)一步評(píng)價(jià)妊娠期應(yīng)用雙黃連凍干粉的安全性提供了毒理學(xué)研究資料，為臨床合理用藥提供參考，但是體外實(shí)驗(yàn)的發(fā)展并不能排斥體內(nèi)實(shí)驗(yàn)本身的重要性，兩者的相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究探索。

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Evaluation of embryotoxicity of baicalin based on embryonic stem cell test system

ZHANG Wei1，2，SONG Dian-rong1，WANG Ya-nan1，ZHU Ze3
(1.Department of Obstetrics and Gynecology，the Second Affiliated Hospital，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300150，China;2.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin300193;3.Tianjin Medical University，Tianjin300070)

OBJECTIVETo assess embryotoxicity of baicalin using embryonic stem(ES)cell test in vitro.METHODSES D3 cells and BALB/c 3T3 cells were cultured respectively with baicalin 20，40，60，80 and 100 mg·L－1.Cell morphology was observed with a phase contrast microscope and absorbance of the resulting colored solution at 570 nm was measured by microplate reader.According to the concentration-effect curve，50%inhibition of cell growth(IC50)and viability were obtained in ES cell line D3〔IC50(D3)〕and in 3T3 cells〔IC50(3T3)〕.ES cells were cultured in baicalin with using hanging drop-suspension-attachment method，then cardiac myoblasts specific genes myosin heavy chain(β-MHC)in differentiation of embryonic stem cell were detected by real time Q-PCR，the growth inhibitory rate was calculated with quantitative analysis，according to the concentration-effect curve，50%inhibition of ES cells differentiation into cardiac myoblasts〔ID50(D3)〕obtained.Baicalin embryotoxicity potential was predicted using statistics formula.RESULTSES D3 cells and BALB/c 3T3 cells viability decreased slowly with the increase in baicalin concentration after they were cultured in different concentration of baicalin for ten days，which showed that baicalin had a certain degree of inhibition on ES D3 cell and BALB/c 3T3 cell proliferation.The half-maximal proliferation-inhibition concentration(IC50)of baicalin on ES cell line D3〔IC50(D3)〕and 3T3 cells〔IC50(3T3)〕was 135.9 mg·L－1and 63.34 mg·L－1.ES cells in vitro by hanging drop-suspension-adherent culture could differentiate to expression of β-MHC gene in myocardial cells.With baicalin 2，5，10，20 and 40 mg·L－1，the ability of ES cells differentiate into myocardial cells gradually decreased，the inhibitory rate was 29.5%，46.8%，59.6%，61.7%and 69.0%，respectively，and this indicated that baicalin had a certain degree of inhibitory effect on ES cells differentiation.The half-maximal differentiation-inhibition concentration(ID50)of baicalin on D3 differentiating into MHC〔ID50(D3)〕was 7.25 mg·L－1.According to the calculation formula of predicting embryo toxicity，baicalin had weak embryotoxicity.CONCLUSIONBaicalin has weak embryotoxicity.

embryonic stem cell;baicalin;toxic actions

The project supported by State Administration of Traditional Chinese Medicine TCM Industry Scientific Research Special project(200707011)

SONG Dian-rong，E-mail:songdr58@126.com

R99，R285.1

A

1000-3002(2012)06-0864-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.06.015

國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(200707011)

張崴(1978－)，女，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事妊娠期用藥安全性研究;宋殿榮(1967－)，女，博士，主任醫(yī)師，主要從事生殖健康研究。

宋殿榮，E-mail:songdr58@126.com，Tel:(022)60335422

2011-10-27接受日期:2012-03-12)

(本文編輯:付良青)