人脂肪來源干細胞與膠原支架共培養(yǎng)的實驗研究

徐明曦 周哲 張明 吳稼晟 李偉 孫康 王忠 趙陽 盧慕峻

人脂肪來源干細胞與膠原支架共培養(yǎng)的實驗研究

徐明曦 周哲 張明 吳稼晟 李偉 孫康 王忠 趙陽 盧慕峻

目的 觀察評價人脂肪來源干細胞（Human adipose derived stem cells，hADSCs）在膠原支架中的生長情況，為進一步體內(nèi)組織修復研究提供依據(jù)。方法 取人抽脂術后脂肪，經(jīng)膠原酶解、過濾、離心獲得hADSCs，代傳代擴增后，接種到膠原支架上。細胞-材料復合物分別體外培養(yǎng)1周、2周，裸鼠體內(nèi)培養(yǎng)2周、4周后，HE染色觀察細胞在支架上的生長情況，免疫組化HLA-Ⅰ檢測經(jīng)裸鼠體內(nèi)培養(yǎng)后的復合物上的細胞的種屬來源。結果 原代培養(yǎng)的hADSCs呈“梭形”或“成纖維細胞”樣，并以克隆團形式生長。免疫熒光Vimentin染色陽性。第3代hADSCs經(jīng)流式細胞鑒定，CD29、CD44、CD105表達陽性，CD45、CD34表達陰性。膠原支架復合hADSCs經(jīng)過體外、體內(nèi)培養(yǎng)，hADSCs均能長入膠原支架的空隙內(nèi)，且體內(nèi)培養(yǎng)比體外培養(yǎng)有更多的細胞長入支架。體外培養(yǎng)1周，已有細胞粘附生長在膠原支架的邊緣，體外培養(yǎng)2周后，更多的細胞滲透到材料內(nèi)部。體內(nèi)培養(yǎng)2周后，大量細胞占據(jù)材料的邊緣，有部分細胞能滲透到材料內(nèi)部甚至材料全層。體內(nèi)培養(yǎng)4周后，大量細胞滲透支架全層。HLA-Ⅰ抗體檢測發(fā)現(xiàn)，支架材料內(nèi)部細胞陽性表達，說明膠原支架內(nèi)部的細胞來源于hADSCs。結論 膠原支架與hADSCs具有較好的相容性，可作為hADSCs的載體材料，用于組織工程缺損修復的研究。

脂肪來源干細胞 膠原 支架 組織工程

臨床上很多組織缺損和器官功能障礙，都缺乏有效的修復手段，傳統(tǒng)外科創(chuàng)傷修復采用“拆東墻補西墻”的模式，造成供區(qū)的傷害。大面積膀胱缺損目前仍以腸道替代為主流方法，面臨腸道切取帶來的一系列并發(fā)癥。組織工程技術的出現(xiàn)為該問題的解決提供了新的思路，研究主要涉及種子細胞和支架材料。

hADSCs具有自我更新及多向分化潛能，體外培養(yǎng)生長能力旺盛，體外擴增和自我更新能力強，通過傳代培養(yǎng)易獲得大量有分化能力的干細胞。因此，hADSCs作為組織工程膀胱修復的種子細胞，成為近年來組織工程膀胱修復研究的熱點之一。

膠原是一種天然蛋白質，廣泛存在于動物的結締組織中，是動物體內(nèi)含量最豐富的蛋白質[1]。膠原是天然高分子生物材料，具有低免疫原性、低毒性，優(yōu)異的生物相容性和生物可降解性，具有促進細胞生長和止血等作用，已廣泛應用于生物醫(yī)學材料和臨床醫(yī)療，是一種理想的組織工程支架材料。

本實驗選擇hADSCs與Ⅰ型牛膠原蛋白支架進行體外、體內(nèi)復合培養(yǎng),觀察hADSCs在膠原支架上的生長情況,探討膠原作為hADSCs的支架材料的可能性，以期用于組織工程膀胱缺損的修復。

1 材料與方法

1.1 材料

hADSCs分離自人抽脂術后廢棄的脂肪組織，Ⅰ型膠原蛋白購自上海物竟科技有限公司,由健康牛跟腱酶解獲得，膠原支架由上海交通大學材料科學與工程學院制作，DMEM培養(yǎng)基等均采用市售產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 hADSCs的分離培養(yǎng)

本實驗研究得到上海交通大學醫(yī)學院倫理委員會批準。取人抽脂術后廢棄的脂肪組織，用含雙抗的PBS反復沖洗，洗去血細胞和麻醉液。加入等體積的0.1%的膠原酶Ⅳ，37℃恒溫振蕩消化1 h。去除上懸的脂肪和上清液，然后用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，每個10 cm培養(yǎng)皿接種25 mL細胞懸液，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行單層細胞培養(yǎng)。48 h后更換培養(yǎng)液1次,以后每3天換液1次。6～8 d細胞生長融合達80%～90%時，經(jīng)0.5%胰酶-EDTA消化,按1:3進行傳代培養(yǎng)。其后一般5 d傳代1次。

1.2.2 hADSCs免疫熒光鑒定

第3代hADSCs消化后接種在細胞爬片上，至細胞達 60%～70%融合時，以40 g/L多聚甲醛固定5 min。0.25%TritonX-100細胞膜通透處理 10 min，兔血清封閉內(nèi)源性非特異抗原。滴加羊抗人Vimentin蛋白單克隆抗體(anti-vimentin，Millipore，USA)，4 ℃過夜；PBS漂洗后，加入兔抗羊的FITC作為二抗，37℃孵育30 min,同時用 4，6二脒基2苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI） 進行細胞核襯染3 min，抗熒光淬滅封固劑封固后于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 hADSCs流式細胞鑒定

hADSCs培養(yǎng)至第3代時，流式細胞技術鑒定hADSCs 表面標記 CD29、CD44、CD105、CD45、CD34的表達情況。待細胞生長至90%融合時進行消化，1 500 r/min離心5 min，吸去上清液。以Buffer溶液重懸細胞，調整細胞密度為3.0×106cells/mL。準備好樣品管 (2 mL EP管)并于管上標記好抗體信息。于每個樣品管內(nèi)各加入100 μL細胞懸液。采用抗體直接標記法，按量于各個樣品管內(nèi)加入相對應的抗體，小心吹打混勻。4℃ 避光孵育30 min。于每個樣品管內(nèi)添加適量（1.5～2 mL）Buffer溶液，小心吹打混勻。1 500 r/min離心5 min，吸去上清液。于每個樣品管內(nèi)加入300 μL Buffer溶液，重懸細胞，上機檢測（anti-CD29、CD44-PE；anti-CD105、CD45、CD34-FITC，Biolegend，USA）。

1.2.4 膠原支架的制備及掃描電鏡觀察

將Ⅰ型膠原蛋白溶解在0.05 mol/L的醋酸溶液中，獲得1 wt%的膠原溶液。接著將膠原溶液真空脫泡后置于模具（長、寬各10 mm，高2 mm）中，-20℃冷凍2 h成固體后，真空凍干48 h，得到膠原海綿。最后將膠原海綿置入玻璃表面皿中，105℃真空熱3交聯(lián)15 h，得到實驗所需的膠原支架。

將上述方法制備得到的膠原支架噴金鍍膜，通過掃描電鏡觀察其表面形貌，并測量材料微孔直徑。

1.2.5 支架材料孔隙率測量

將制備得到的膠原樣品烘干，電子分析天平精確稱得干燥質量M0，記下長度a、寬度b及高度c，在室溫下于100倍質量去離子水中浸泡30 min。取出后用濾紙吸干表面水分，待無明顯水漬溢出，用分析天平稱濕重 M1。孔隙率 n=(m1-m0)/(a×b×c)×100%。

1.2.6 hADSCs與膠原支架共培養(yǎng)

將膠原支架，置于75%乙醇中浸泡過夜。將消毒后的膠原支架裁制成5 mm×5 mm大小，放入六孔板內(nèi)，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，預培養(yǎng)過夜。第二天，吸棄上清及材料表面的培養(yǎng)基。選取生長良好的第3代hADSCs，制成密度為2×106cells/mL細胞懸液，每個材料表面加1 mL細胞懸液。靜置2 h后再加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。用于體內(nèi)試驗的細胞材料復合物，在體外培養(yǎng)3 h后，植入裸鼠皮下。用于體外實驗的支架，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天換液1次。

1.2.7 細胞-材料復合物組織學檢測

空白膠原支架直接取材，體外培養(yǎng)的支架于培養(yǎng)后1周、2周取材，體內(nèi)培養(yǎng)的支架于培養(yǎng)后2周、4周取材。常規(guī)制作石蠟切片，切成厚5 μm的切片行相關組織學檢測。HE染色觀察細胞在支架內(nèi)的生長情況。

1.2.8 hADSCs復合膠原支架體內(nèi)培養(yǎng)的免疫組化HLA-Ⅰ檢測

hADSCs復合膠原支架體內(nèi)培養(yǎng)2周和4周的石蠟切片，行常規(guī)免疫組化檢測，其中一抗是兔抗人HLA-Ⅰ抗體（anti-HLA-Ⅰ，Epitomics，USA），4 ℃過夜。二抗是偶聯(lián)過氧化物酶的羊抗兔單克隆抗體，DAB顯色，蘇木素襯染，中性樹膠封片。

2 結果

2.1 hADSCs的形態(tài)、生長特性

經(jīng)膠原酶消化后的原代細胞培養(yǎng)6 h后,已有部分成纖維細胞樣形態(tài)的細胞貼壁,大部分未貼壁細胞為球形或圓形的血細胞，培養(yǎng)液中上浮大小不等的脂滴。培養(yǎng)48 h第1次換液，除去大部分未貼壁細胞后，貼壁細胞呈梭形，其間也可見少量三角形、多邊形細胞。隨著培養(yǎng)時間的延長，這些貼壁細胞呈集落狀生長，大小不一，含數(shù)個至數(shù)百個細胞不等，細胞呈梭形。培養(yǎng)6～8 d可達80%～90%致密層（圖1A），9～10 d可形成100%融合的致密單層。傳代后的細胞形態(tài)主要為梭形,少數(shù)為三角形或多邊形。傳代后細胞生長速度較原代細胞明顯增快，按1∶3 傳代，4～5 d 即可長滿。

2.2 hADSCs免疫熒光及流式鑒定

第3代hADSCs免疫熒光染色顯示，間充質干細胞標記Vimentin表達陽性（圖1B）。第3代hADSCs流式細胞鑒定[2]發(fā)現(xiàn)，CD29表達為99.58%，CD44表達為91.83%，CD105表達為85.45%，CD45表達為0.25%，CD34表達為 3.19%（圖2）。

2.3 支架材料的構建

通過冷凍干燥技術，以及真空熱交聯(lián)的方法制備了膠原多孔支架（圖3），掃描電鏡觀察膠原支架孔徑在100 μm左右（圖4），能為細胞的增殖提供足夠的空間，孔隙率為73.79%。

2.4 細胞和支架材料的復合情況

在接種hADSCs前,膠原支架約為5 mm×5 mm。接種hADSCs體內(nèi)培養(yǎng)2周、4周后，材料有不同程度的收縮。hADSCs接種至膠原支架體外培養(yǎng)1周、2周，體內(nèi)培養(yǎng)2周、4周，取材進行組織學檢測。結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過體外、體內(nèi)培養(yǎng)，hADSCs均能長入膠原支架的孔隙內(nèi)，且體內(nèi)培養(yǎng)比體外培養(yǎng)有更多的細胞長入支架。體外培養(yǎng)1周，已有細胞粘附生長在膠原支架的邊緣；體外培養(yǎng)2周后，更多的細胞滲透到材料內(nèi)部。體內(nèi)培養(yǎng)2周后，大量細胞占據(jù)材料的邊緣，有部分細胞能滲透到材料內(nèi)部甚至材料全層；體內(nèi)培養(yǎng)4周后，大量hADSCs細胞滲透支架全層（圖5）。同時HLA-Ⅰ抗體檢測發(fā)現(xiàn)，支架材料內(nèi)部細胞陽性表達，說明膠原支架內(nèi)部的細胞來源于hADSCs（圖6）。

圖1 人脂肪來源干細胞Fig.1 hADSCs

圖2 第3代ADSCs流式鑒定Fig.2 Phenotypes of hADSCs at the third passage

圖3 空白膠原支架材料Fig.3 Collagen scaffold

圖4 膠原支架掃描電鏡觀察（100×）Fig.4 The scanning electron microscopy of collagen scaffolds(100×)

圖5 hADSCs復合膠原支架體內(nèi)及體外培養(yǎng)的組織學檢測（HE染色，200×）Fig.5 Morphological observation of collagen scaffold compound with hADSCs after cultured in vitro and in vivo(Hematoxylin-eosin staining,200×)

圖6 hADSCs復合膠原支架體內(nèi)培養(yǎng)HLA-Ⅰ免疫組化檢測（200×）Fig.6 Immunohistochemical observation of hADSCs compound with collagen scaffold after cultured in vivo(200×)

3 討論

組織工程膀胱缺損的修復主要涉及平滑肌細胞（Smooth muscle cell，SMC）和尿路上皮細胞（Urothelial，UC）的修復。研究表明，ADSCs通過體內(nèi)外誘導能夠向SMC分化，表達平滑肌特異性的標志物并具備收縮和舒張的功能，可以用于修復膀胱肌層缺損[3-8]。有報道認為，在體外可以誘導ADSCs沿著尿路上皮的方向分化[9-10]。與其他組織來源相比，脂肪組織具有來源豐富，取材方便，對患者損傷小，脂肪來源干細胞易于培養(yǎng)和擴增，具有表面抗原和相關標志物，同時具有和骨髓基質干細胞相似的多向分化能力，逐漸成為組織工程膀胱修復種子細胞的理想來源。

理想的載體材料應該具有良好的組織相容性、生物降解性、生物活性等[11-13]。由于在進化過程中的保守性，膠原保留了原始的氨基酸順序，從動物中提取的膠原具有與人體膠原相近的氨基酸序列[14]，使其具有較低的抗原性。同時，膠原具有特異性的分子識別信號，可促進細胞的黏附和增殖，誘導細胞的分化，為細胞生長提供支架[15]。膠原在體內(nèi)降解產(chǎn)物為各種氨基酸，安全無毒，無刺激性，無致敏源。文獻報道，膠原與多種細胞在體內(nèi)外具有良好的生物相容性[16-21]，膠原與其他材料復合構成的復合材料同樣具有良好的生物相容性[22-24]，膠原材料是較為理想的細胞生長基質。

本實驗選用膠原支架與hADSCs在體外、體內(nèi)復合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)ADSCs均能長入膠原支架的空隙內(nèi)，說明膠原支架具有良好的細胞親和性，且體內(nèi)培養(yǎng)比體外培養(yǎng)有更多的細胞長入支架，可能是由于體內(nèi)微環(huán)境更適合植入的種子細胞的生長。體外培養(yǎng)1周，已有細胞粘附生長在膠原支架的邊緣，體外培養(yǎng)2周后，更多的細胞滲透到支架內(nèi)部。體內(nèi)培養(yǎng)2周后，大量細胞占據(jù)支架的邊緣，有部分細胞能滲透到支架內(nèi)部甚至全層，體內(nèi)培養(yǎng)4周后，大量細胞滲透支架全層。

本實驗結果提示，hADSCs能在膠原支架上較好生長，膠原支架可以作為hADSCs的載體材料，用于組織工程膀胱修復的研究。

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The Study of Combination of Human Adipose-Derived Stem Cells with Collagen Scaffold

XU Mingxi1,ZHOU Zhe1,ZHANG Ming1,WU Jiasheng2,LI Wei2,SUN Kang2,WANG Zhong1,ZHAO Yang1,LU Mujun1.1 Department of Urology,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;2 State Key Lab of Metal Matrix Composites,Shanghai Jiaotong University School of Materials Science and Engineering,Shanghai 200240,China.Joint First Authors:XU Mingxi,ZHOU Zhe.

LU Mujun(E-mail:lumujun@163.com).

ObjectiveTo observe the growth of human adipose derived stem cells co-culture with collagen biomaterials in vitro and in vivo.MethodshADSCs were isolated from human subcutaneous adipose tissue after collagenase digesting,filtrating and centrifuging.Then the 3 passage of hADSCs were seeded onto the collagen scaffolds and the growth of hADSCs co-culture with collagen biomaterials were observed by using Haematoxylin-Eosin staining,meanwhile the cells in the scaffolds cultured in vivo were detected by immunohistochemistry.ResultsPrimary cultured hADSCs were spindle-shaped or fibroblasts-liked cells,and it could form the clone groups.Immunofluorescence identification of Vimentin was positive,and Flow cytometry results showed that 3 passage of ADSCs were positive for CD29,CD44,CD105,but negative for CD34,CD45.The histological study found that after cultured both in vitro and in vivo,hADSCs could grow in the space of the collagen scaffolds,moreover there were more cells in the scaffolds cultured in vivo than in vitro.When cultured in vitro,a few cells adhered at the edge of the collage 1 week later and more cells grew into the inside of the scaffolds after 2 weeks.When cultured in vivo,several cells were found at the edge of the scaffolds and parts of cells had grown into the inside even the whole layer of the scaffolds after 2 weeks,at the 4th week,a great deal of cells grew into the whole layer of the scaffolds.Simultaneously,immunohistochemistry results suggested the cells in the scaffolds’inside cultured in vivo were from hADSCs.ConclusionCollagen scaffolds have a good biocompatibility with hADSCs,which can be used as a vehicle for hADSCs to repair tissue defect.

Human adipose derived stem cells;Collagen;Scaffold;Tissue engineering

Q813.1+1

A

1673－0364（2012）04－0189－06

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.04.003

國家自然科學基金面上項目(81070605)；上海交通大學“醫(yī)工(理)交叉研究基金”(YG2011MS14)；上海市教委科研創(chuàng)新項目(09YZ76)。

200011 上海市 上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院泌尿外科（徐明曦，周哲，張明，王忠，趙陽，盧慕峻）。200240上海市 上海交通大學材料科學與工程學院金屬基復合材料國家重點實驗室（吳稼晟，李偉，孫康）。

盧慕峻（E－mail:lumujun@163.com）。

注：徐明曦，周哲為本文共同第一作者。

2012年6月21日；

2012年7月16日）