應(yīng)力介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展

周佳 綜述 李青峰 審閱

應(yīng)力介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展

周佳 綜述 李青峰 審閱

應(yīng)力改變介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，研究該機(jī)制可為相關(guān)疾病提供預(yù)防、治療的方法。本文就細(xì)胞凋亡的基本特點(diǎn)、應(yīng)力介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的相關(guān)研究、應(yīng)力模型的建立及凋亡檢測的方法等方面進(jìn)行綜述。

凋亡 應(yīng)力 檢測

細(xì)胞凋亡（Apoptosis）是由特定基因控制的細(xì)胞自主的、有序性的死亡，又稱程序性細(xì)胞死亡 （Programmed Cell Death，PCD）[1]。外界環(huán)境因素改變可以觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序，而引發(fā)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的基本特征之一，與細(xì)胞增殖共同維持機(jī)體正常生長發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。研究應(yīng)力與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性，可以有效地了解與組織應(yīng)力改變相關(guān)的疾病的發(fā)生、發(fā)展情況，探索與組織應(yīng)力改變相關(guān)的治療方法的可行性。本文就細(xì)胞應(yīng)力改變介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡方面的研究進(jìn)行綜述。

1 細(xì)胞凋亡概述

研究證實(shí)，細(xì)胞凋亡存在兩條起始途徑：外源性途徑和內(nèi)在途徑[2]。外源性途徑即死亡受體途徑，外界刺激通過細(xì)胞膜上的凋亡受體觸發(fā)細(xì)胞凋亡；內(nèi)在途徑又稱為線粒體途徑，細(xì)胞環(huán)境改變后，線粒體膜電位改變觸發(fā)細(xì)胞凋亡。兩種途徑最終均激活caspases-3（半胱氨酸蛋白酶），完成細(xì)胞凋亡。細(xì)胞應(yīng)力發(fā)生一定程度改變時(shí)，胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)將受力信號傳遞給線粒體，細(xì)胞可以通過內(nèi)在途徑發(fā)生凋亡。

1.1 細(xì)胞調(diào)亡的形態(tài)學(xué)特征和生物化學(xué)改變

典型凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化過程包括：早期細(xì)胞體皺縮，細(xì)胞器完整但緊密壓縮，核收縮，染色質(zhì)濃縮于核膜周邊，然后核裂解成碎塊，胞膜逐漸突起，出芽形成大皰，而后大皰從凋亡細(xì)胞表面脫離出來，形成“凋亡小體”，最后凋亡小體被吞噬細(xì)胞吞噬，一般不出現(xiàn)炎癥反應(yīng)[3-5]。

凋亡細(xì)胞的胞膜成分亦發(fā)生改變，在凋亡早期，原來位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酸酰氨酸（Phosphatidylserine，PS）遷移至脂雙層外側(cè)。

細(xì)胞凋亡時(shí)，核小體間的雙鏈DNA的斷裂，導(dǎo)致形成多個180～200 bp，或其整數(shù)倍為單位的DNA片段。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測可見特征性梯狀帶。

1.2 細(xì)胞凋亡的調(diào)控

細(xì)胞凋亡是由多基因控制，在多因素參與下通過復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)的。目前，對凋亡的調(diào)控已經(jīng)有了一定的了解，在基因的表達(dá)層面，促凋亡基因 ced-3、ced-4、c-Myb、c-Myc、p53、MyD118、GADD45、ICE、Bax 等，抑凋亡基因 ced-9、Bcl-2、Bcl-xL、MCL1、MyD116等參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控；在凋亡過程中 Ca2+，pH 值，膜電位等生理信號，TNF-α、INF-γ等細(xì)胞因子，F(xiàn)as、TRAIL、APO-3、caspase 蛋白水解酶家族等因子在其中發(fā)揮了重要的作用[6-8]。

2 細(xì)胞應(yīng)力改變與細(xì)胞凋亡的相關(guān)研究

細(xì)胞存活的應(yīng)力條件將對細(xì)胞的凋亡行為產(chǎn)生重要的影響，近年來隨著生物學(xué)家對這一問題的關(guān)注，細(xì)胞應(yīng)力與細(xì)胞凋亡的相互作用關(guān)系已逐步得到揭示。Fong等[9]采用應(yīng)力模式化培養(yǎng)的顱骨成骨細(xì)胞來控制細(xì)胞的形態(tài)和面積，研究結(jié)果表明成骨細(xì)胞的凋亡率隨著鋪展面積的增大而降低。細(xì)胞的活性受面積的影響，同時(shí)細(xì)胞的鋪展形態(tài)也有重要的調(diào)節(jié)作用。郭子義等[10]研究了動脈血流切應(yīng)力變化對血管平滑肌細(xì)胞（Vascula smooth muscle cells，VSMC）凋亡的影響，結(jié)果顯示零應(yīng)力條件下VSMC的凋亡和去分化明顯增加。Sotoudeh等[11]報(bào)道在高血壓條件下可引起死亡受體的聚集，從而導(dǎo)致VSMC的凋亡。胡佳等[12]指出，流體剪切力達(dá)到40 cmH2O時(shí)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和凋亡進(jìn)程并有一定時(shí)相性的變化規(guī)律，同時(shí)P53、Bcl-2與Fas蛋白在凋亡發(fā)生發(fā)展中的不同時(shí)期起到相應(yīng)的調(diào)控作用。佟俊杰等[13]的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了周期性張應(yīng)力能導(dǎo)致牙周成纖維細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而為臨床咬牙合創(chuàng)傷即咬牙合力造成牙周損害疾病的預(yù)防和治療提供了理論依據(jù)。Hawwa等[14]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，肺成纖維細(xì)胞在周期性牽引力的作用下，凋亡現(xiàn)象較對照組增加3倍以上。Lo等[15]在包被膠原并有硬度梯度的聚丙烯酰胺片上培養(yǎng)3T3細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)3T3成纖維細(xì)胞可以探測出基底的硬度并作出響應(yīng)；當(dāng)細(xì)胞從軟基底區(qū)域進(jìn)入硬基底區(qū)域時(shí)，細(xì)胞會轉(zhuǎn)向90°，其遷移的速度會瞬時(shí)增加，細(xì)胞鋪展面積增加。從以上論述可見，細(xì)胞應(yīng)力條件對細(xì)胞凋亡的行為有著重要的影響，并為各種臨床疾病的預(yù)防、治療提供理論指導(dǎo)。

3 應(yīng)力作用模型

1975年，Rodan等用軟骨和骨細(xì)胞進(jìn)行流體靜壓加載，開創(chuàng)了機(jī)械應(yīng)力應(yīng)用于細(xì)胞和組織研究的方法。隨后的研究中，出現(xiàn)了多種多樣的裝置用于構(gòu)建受力模型[16-17]。

3.1 壓應(yīng)力作用模型

3.1.1 重物加力法

重物加力法是將重物直接對培養(yǎng)的細(xì)胞和組織加力的方法，通過改變物體的重量調(diào)節(jié)施加壓應(yīng)力的大小。該加力方法產(chǎn)生持續(xù)性靜壓力。

3.1.2 液壓加力法

液壓加力法是利用流體靜壓對在體外培養(yǎng)的細(xì)胞和組織加力的方法，應(yīng)用高壓裝置或減壓裝置改變培養(yǎng)液對細(xì)胞和組織產(chǎn)生的靜壓力大小。包括正壓與負(fù)壓兩種方式。流體靜壓作用培養(yǎng)細(xì)胞和組織的研究模型設(shè)備簡單，刺激均勻，易于傳導(dǎo)靜止或短時(shí)的應(yīng)力。

3.1.3 離心加力法

離心力也被認(rèn)為是一種壓應(yīng)力。有學(xué)者用水平微板轉(zhuǎn)盤對培養(yǎng)的細(xì)胞施加離心力。離心加力法通過調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)半徑、轉(zhuǎn)速來改變加力大小，可以產(chǎn)生持續(xù)性或間歇性壓力[18]。

3.2 牽張力作用模型

目前，牽張力主要是由基底形變加力模型產(chǎn)生，使用最廣的是以基底形變?yōu)榛A(chǔ)的加力裝置。其基本原理是通過基底彎曲變形或水平拉伸使附著于基底生長的細(xì)胞被拉伸或壓縮。1991年，Andersen等最早報(bào)道了用“圓頂”造成基底形變，對細(xì)胞施加最大1%雙軸張應(yīng)變的方法。

3.2.1 平面外牽拉基底變形的應(yīng)力作用模型

平面外牽拉基底變形的應(yīng)力作用模型是通過基底彎曲變形來產(chǎn)生牽張力的模型。

3.2.1.1 單向牽拉彈性膜片變形應(yīng)力作用模型

最初有學(xué)者在矩形的基底下放置半圓形支架，形成基底的形變，產(chǎn)生牽張力。近年來出現(xiàn)了四點(diǎn)彎曲模型，利用呈矩形的四個著力點(diǎn)，垂直對基底加力，基底形變產(chǎn)生牽張力。單向牽張力發(fā)生模型穩(wěn)定，尤其適用于有方向性應(yīng)力要求的細(xì)胞和組織的研究[19]。

3.2.1.2 非單向牽拉彈性膜片變形的應(yīng)力作用模型

當(dāng)基底是圓形時(shí)，將力垂直作用于基底，基底形變產(chǎn)生的牽張力是多方向的。目前最常用的裝置是利用負(fù)壓吸引形成基底形變。隨著裝置的不斷改進(jìn)，該作用模型產(chǎn)生的牽張力穩(wěn)定、精準(zhǔn)，操作便捷，但仍存在基底受力不均的缺點(diǎn)[20]。

3.2.2 平面作用牽拉基底變形的應(yīng)力作用模型

平面作用牽拉基底變形的應(yīng)力作用模型中，細(xì)胞培養(yǎng)的基底放置在一個平臺上，基底的四周與牽拉裝置相連，例如Flexcell系統(tǒng)通過負(fù)壓使彈性膜邊緣拉伸，改變其長度形成基底的牽張力。通過調(diào)節(jié)彈性底面的水平形變量，控制細(xì)胞受力的大小和方向?？梢援a(chǎn)生單向牽張力、雙向牽張力。如果平面基質(zhì)是圓形的，在中央圓形基底部位的膜即受到各個方向均勻的牽張力[21]。

3.3 流體切變應(yīng)力模型

其原理是使用流體切變應(yīng)力對細(xì)胞進(jìn)行作用。包括兩種裝置：錐體-平面系統(tǒng)，通過調(diào)整錐體的形狀與旋轉(zhuǎn)錐體的角速度獲得流體切變力；另一種裝置則稱為平行平板流動槽，利用裝置入口與出口的壓力變化來改變流體切變率，通過調(diào)整裝置的尺寸以及比例獲得多種流體切變參數(shù)[22]。

4 細(xì)胞凋亡的檢測方法

4.1 電子顯微鏡細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測

透射電鏡和掃描電鏡下可以觀察到凋亡細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征的改變。此方法是定性凋亡細(xì)胞的可靠方法，為細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察的金指標(biāo)。

4.2 細(xì)胞生化檢測

DNA Ladder帶檢測，細(xì)胞凋亡時(shí)，由于DNA被裂解成單個核小體和寡聚核小體，電泳時(shí)呈現(xiàn)特征性的180～200 bp DNA階梯狀條帶。

由末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase，TDT）介導(dǎo)的 dUTP 缺口末端標(biāo)記技術(shù)（TUNEL），是原位末端標(biāo)記法（In Situ End-Labeling，ISEL）中的一種。其基本原理是將滲入到凋亡細(xì)胞中的外源性核苷酸在酶的催化下與凋亡細(xì)胞因內(nèi)源性核酸酶激活而產(chǎn)生的單股或雙股斷鏈相結(jié)合，再通過一定的顯示系統(tǒng)使之顯示出來。即將熒光素或同位素標(biāo)記的dUTP接到斷裂DNA的3'-0H端發(fā)生聚合反應(yīng)，然后進(jìn)行檢測[23]。

線粒體膜電位的降低是凋亡細(xì)胞早期的特征性改變，發(fā)生在形態(tài)學(xué)改變之前，且被認(rèn)為是不可逆的。由于線粒體膜電位的存在，能使一些親脂性的陽離子熒光染料與線粒體的基質(zhì)相結(jié)合，這些染料如羅丹明123、JC-1等與線粒體的基質(zhì)結(jié)合可以用來檢測線粒體膜電位的變化[24]。當(dāng)細(xì)胞MMP降低時(shí)，其熒光強(qiáng)度降低，也就是說線粒體基質(zhì)的熒光增強(qiáng)或減弱能說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性增強(qiáng)或降低。

4.3 免疫學(xué)檢測方法

免疫組化廣泛應(yīng)用于凋亡細(xì)胞的基因表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)各因子水平和蛋白質(zhì)含量等的分析。

4.4 流式細(xì)胞儀檢測

流式細(xì)胞儀不僅可以從形態(tài)上分析細(xì)胞是否存在凋亡，還可從染色質(zhì)、離子、蛋白等多方面檢測細(xì)胞凋亡[25]。

碘化丙啶（Propidum iodide，PI）染色法DNA含量測定，PI熒光染料分子不能進(jìn)入完整的細(xì)胞膜，但細(xì)胞經(jīng)固定、打孔后PI可直接進(jìn)入細(xì)胞，插入到DNA堿基對之間，流式細(xì)胞儀通過檢測摻入的PI熒光強(qiáng)度來顯示DNA含量。凋亡細(xì)胞DNA含量降低，故在正常的G0/G1峰前有一亞G0/G1峰出現(xiàn)，即為凋亡峰（AP峰）。

膜聯(lián)蛋白法：磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。膜聯(lián)蛋白（Annexin V）是一種分子量為35～36 KDa的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將膜聯(lián)蛋白V進(jìn)行熒光素標(biāo)記，以標(biāo)記了的膜聯(lián)蛋白V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

4.5 分子探針檢測

分子探針在分子影像學(xué)中是指對某一特定生物分子（如蛋白質(zhì)、DNA、RNA）具有特異性靶向的、并能夠進(jìn)行體內(nèi)或/和體外示蹤的標(biāo)記分子，這些標(biāo)記分子能夠在體內(nèi)或/和離體反映其靶生物分子的量或/和功能，通常由信號組件和親和組件兩部分組成[26－27]。在細(xì)胞凋亡的分子成像研究中，根據(jù)信號組件的成分可分為放射性核素、熒光素、含熒光基團(tuán)標(biāo)記的分子探針。凋亡研究的親和組件有兩種：以Caspase為靶標(biāo)的凋亡影像探針和以Annexin V親和組件為靶標(biāo)的凋亡探針。

細(xì)胞形式的凋亡檢測適用于以上各種類型的檢測方法。組織形式的凋亡檢測可采用電鏡檢測、TUNEL法。分子影像技術(shù)可用于在體凋亡檢測。

5 展望

應(yīng)力條件下細(xì)胞凋亡行為的改變與多種臨床疾病相關(guān)。在整形外科領(lǐng)域，牽拉顱面骨獲得增生的骨質(zhì)、應(yīng)用軟組織擴(kuò)張器獲得額外的皮膚，這些以機(jī)械力刺激組織再生的技術(shù)已在臨床中廣泛應(yīng)用，但作用機(jī)理的研究仍不夠完善。在這些機(jī)械力刺激組織再生的現(xiàn)象中，應(yīng)力介導(dǎo)凋亡狀態(tài)改變也是必要的研究內(nèi)容之一。分子探針提供了一種在體研究的凋亡檢測手段。分子影像學(xué)也以一種全新的科學(xué)觀察方法即非侵入性的方式，實(shí)現(xiàn)對活體內(nèi)參與生理和病理過程的分子進(jìn)行定性或定量的可視化分析，為細(xì)胞凋亡成像研究引入了新的思維方式和研究手段。

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Research Progress of Stress-induced Apoptosis

ZHOU Jia,LI Qingfeng.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.

LI Qingfeng(E-mail:liqfliqf@yahoo.com.cn).

Apoptosis;Mechanical stress;Detection

Q255

B

1673－0364（2012）04－0235－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.04.016

200011 上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

李青峰（E-mail：liqfliqf@yahoo.com.cn）。

【Summary】Mechanical stress-induced apoptosis,as programmed cell death,is often correlated with many diseases.Research of mechanical stress-induced apoptosis could provide the prevention and therapy of relative diseases.In this review,the basic features of apoptosis,relative research of stress-induced apoptosis,the establishment of the strain model and the methods of cell apoptosis detection are all reviewed.The research direction of stress-induced apoptosis is also proposed.

2012年4月12日；

2012年5月7日）