黃花菜多糖的超聲提取工藝研究

白雪松，杜 鵑，杜澤輝 (吉林醫(yī)藥學(xué)院營(yíng)養(yǎng)教研室，吉林吉林 132013)

黃花菜多糖的超聲提取工藝研究

白雪松，杜 鵑，杜澤輝 (吉林醫(yī)藥學(xué)院營(yíng)養(yǎng)教研室，吉林吉林 132013)

目的探索黃花菜中粗多糖的超聲提取工藝。方法黃花菜干粉經(jīng)脫脂，超聲波提取，Sevag法除蛋白，醇沉，真空抽濾，得到黃花菜粗多糖。從超聲頻率、提取溫度、提取時(shí)間、料液比4個(gè)方面對(duì)提取率進(jìn)行了分析。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)正交試驗(yàn)篩選出最佳提取工藝條件。用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖的含量。結(jié)果正交試驗(yàn)得出黃花菜多糖的最佳提取工藝為水料比1∶20，超聲功率60 Hz，提取溫度60℃，提取時(shí)間15 min，該條件下黃花菜中粗多糖含量為9.67%。結(jié)論采用超聲方法提取多糖節(jié)省時(shí)間，提取多糖的含量高。

黃花菜;粗多糖;超聲提取;正交試驗(yàn)

黃花菜(Hemerocallis fulva)又名金針菜、忘憂草、萱草，俗名金針花，為百合科多年生草本植物，《本草綱目》記載黃花菜有安神醒腦、增智寬胸、美容養(yǎng)血、解熱消毒、除煩通乳之功效。黃花菜鮮甜味美，葷素兼優(yōu)，在中國(guó)醫(yī)學(xué)3000多年的食療歷史中，黃花菜被列為常用食療食品之一［1］。黃花菜營(yíng)養(yǎng)豐富，含有糖類、蛋白質(zhì)、維生素、無(wú)機(jī)鹽及多種人體必需的氨基酸。在現(xiàn)代生活中，黃花菜與香菇、木耳、冬筍一起被稱為蔬菜類中的四大珍品［2］。植物多糖是一類由單糖組成的天然高分子化合物，廣泛存在于多種植物中。大量藥理及臨床研究證實(shí)，多糖有調(diào)節(jié)免疫、抗癌、抗肥胖、控制血糖、降膽固醇、降血脂等生理功能，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品及功能食品［3］，因此對(duì)植物多糖的研究已成為醫(yī)藥界的熱門領(lǐng)域。本研究采用單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)超聲波法提取黃花菜多糖的最佳條件進(jìn)行研究，探尋黃花菜多糖制備工藝，為進(jìn)一步開發(fā)黃花菜提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器

黃花菜購(gòu)于吉林市;KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);SHB-111A型循環(huán)水式多用真空泵(上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司);RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);UV-1800型紫外分光光度計(jì)(日本島津);ZN-500A型高速中藥粉碎機(jī)(長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)中南制藥機(jī)械廠);HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);202-1型電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);FA1104N型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);所用試劑濃硫酸、葡萄糖、苯酚、正丁醇、丙酮、氫氧化鈉、鹽酸、三氯甲烷、乙醚、95%乙醇、無(wú)水乙醇均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 樣品處理

提取工藝:黃花菜→干燥→粉碎→脫脂→脫單糖、低聚糖→超聲波萃取→過(guò)濾→濾液濃縮→醇沉→過(guò)濾→干燥→得黃花菜粗多糖。

將黃花菜放于烘箱在60℃烘烤12 h，烘干后，放于粉碎機(jī)中粉碎成粉末，過(guò)60目篩，得黃花菜粉末放于蒸發(fā)皿，置于干燥器中備用。使用電子天平稱取干燥的黃花菜粉末2.000 0 g，用濾紙包成包，放到索氏提取器中，使用乙醚進(jìn)行脫脂，回流時(shí)間4 h左右，至濾液呈無(wú)色透明，說(shuō)明脫脂完全。用80%的乙醇在室溫50 Hz超聲提取30min脫去單糖，低聚糖及色素。取出后，放置室內(nèi)通風(fēng)處晾干24 h。

1.3 黃花菜粗多糖的提取

取5個(gè)錐形瓶，分別放入0.25 g脫脂脫糖后黃花菜粉，根據(jù)單因素和正交試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的要求提取，之后使用四層紗布過(guò)濾，將濾液放入分液漏斗中，加入Sevag試劑(氯仿∶正丁醇 =4∶1)劇烈振蕩15 min，靜置25 min，棄去下面的有機(jī)層和蛋白層，得黃色溶液，反復(fù)多次，至無(wú)明顯蛋白質(zhì)出現(xiàn)為止，將得到液體置入150 mL錐形瓶?；诙嗵鞘菢O性大分子化合物，可溶于水而不溶于醇的特點(diǎn)。待除蛋白后的液體冷卻至室溫后，邊攪拌邊向濃縮液中加入5倍體積的95%的乙醇進(jìn)行醇沉，于冰箱中冷藏靜置24 h。取出醇沉完全的粗多糖提取液，使用真空抽濾機(jī)，將溶液中的多糖析出到濾紙上，使用丙酮，無(wú)水乙醇洗滌，將析出的多糖放在室內(nèi)晾干2 h，再放到烘干箱中于60℃烘干2 h至恒重，得黃花菜粗多糖。

1.4 黃花菜多糖含量的測(cè)定

稱取50.50 mg的已經(jīng)干燥好的黃花菜多糖的粗品，用蒸餾水溶解后定容至500 mL，吸取1 mL樣液，分別放入5個(gè)具塞比色管中，再分別向其中加入1 mL 5%的苯酚，5 mL的濃硫酸，靜置25 min，使用紫外分光光度計(jì)，測(cè)得各管吸光度值。樣品中多糖含量的計(jì)算可以根據(jù)下列公式計(jì)算得到:

1.5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取干燥至恒重的葡萄糖5.05 mg，加適量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，配成濃度為101.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液備用。精密吸取濃度為101.0 μg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于比色管中，依次加水使最終體積為1 mL，同時(shí)吸取1 mL蒸餾水于10 mL比色管中作空白對(duì)照，分別加入5%苯酚1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，室溫放置25 min。于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，同時(shí)以蒸餾水作為空白。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。

1.6 單因素實(shí)驗(yàn)

使用超聲提取各單因素對(duì)多糖提取有影響，影響超聲波提取的因素主要有超聲波提取時(shí)間、提取溫度、超聲頻率、水料比四個(gè)因素。確定四種因素對(duì)多糖含量提取的影響。

1.6.1 超聲頻率對(duì)黃花菜粗多糖含量提取的影響

取5個(gè)錐形瓶，分別取0.250 g脫脂脫糖后黃花菜粉，先確定提取溫度50℃，提取時(shí)間10 min，水料比1∶20，分別在五個(gè)超聲功率 40、50、60、70、80 Hz下提取，確定最佳提取頻率。

1.6.2 提取時(shí)間對(duì)黃花菜粗多糖含量提取的影響

準(zhǔn)確稱取黃花菜干粉0.250 g，料液比為1∶20，溫度50℃，超聲頻率50 Hz，選擇不同的提取時(shí)間5、10、15、20、25 min進(jìn)行超聲波提取，確定最佳提取時(shí)間。

1.6.3 水料比對(duì)黃花菜粗多糖含量提取的影響

準(zhǔn)確稱取黃花菜干粉0.250 g，提取時(shí)間10 min，溫度50℃，超聲頻率70 Hz，選擇不同的水料比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 進(jìn)行超聲波提取，確定最佳水料比。

1.6.4 提取溫度對(duì)黃花菜粗多糖含量提取的影響

準(zhǔn)確稱取黃花菜干粉0.250 g，水料比為1∶20，提取時(shí)間10 min，超聲頻率50 Hz，選擇不同的提取溫度 40、50、60、70、80 ℃進(jìn)行超聲波提取，確定最佳提取溫度。

1.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用L9(34)正交表以水料比(A)，提取溫度(B)，提取時(shí)間(C)，超聲頻率(D)四個(gè)因素，選取各因素的較優(yōu)區(qū)域3個(gè)水平做正交實(shí)驗(yàn)，每次做3個(gè)平行，取平均值。

表1 黃花菜中粗多糖超聲提取正交試驗(yàn)

1.8 最優(yōu)條件下提取黃花菜中粗多糖含量

準(zhǔn)確稱取黃花菜干粉2.000 0 g，水料比1∶20，超聲頻率60 Hz，提取溫度60℃，提取時(shí)間15 min，進(jìn)行超聲波提取，得總粗多糖含量，本次試驗(yàn)做三個(gè)平行。

1.9 黃花菜多糖的回收率試驗(yàn)

向黃花菜中總粗多糖加入100.8 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

超聲頻率對(duì)黃花菜中粗多糖含量提取的影響:在40～60 Hz超聲頻率范圍內(nèi)，隨著超聲頻率的增加，提取多糖的含量也明顯增多，當(dāng)頻率超過(guò)60 Hz時(shí)，粗多糖含量提取明顯下降，可能由于超聲頻率過(guò)快，導(dǎo)致多糖被破壞。

提取時(shí)間對(duì)黃花菜中粗多糖含量的影響:粗多糖含量隨提取時(shí)間的增加而增大，提取初期粗多糖含量增長(zhǎng)很快，10～15 min時(shí)多糖的提取率很高，但是超過(guò)15 min，多糖的提取率逐漸下降，可能是因?yàn)闇囟壬邔?dǎo)致部分多糖降解。

水料比對(duì)黃花菜中粗多糖含量提取的影響:水料比在1∶10～1∶20時(shí)，黃花菜中粗多糖含量明顯增加，當(dāng)水料比在1∶20～1∶30時(shí)，提取的粗多糖含量明顯下降，在水料比為1∶20時(shí)，提取率最高。隨料液量的比例增加，多糖的提取率反而降低，可能是因?yàn)橐恍╇s質(zhì)的析出抑制了多糖的提取。

提取溫度對(duì)黃花菜中粗多糖含量提取的影響:隨著提取溫度的增加，黃花菜中的粗多糖含量先增加后降低，提取溫度在50℃時(shí)，粗多糖提取含量值最大，超過(guò)50℃后，隨著溫度的增高，多糖提取率逐漸下降，說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間受熱會(huì)導(dǎo)致多糖的分解。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2顯示，從r值大小可以看出水料比對(duì)黃花菜中粗多糖提取效果的影響最大，超聲頻率次之，提取溫度和提取時(shí)間的影響最小。最佳提取工藝組合即A3B2C2D3，即提取黃花菜中粗多糖的最佳提取工藝條件:水料比1∶20，超聲頻率60 Hz，提取溫度60℃，提取時(shí)間15 min。

表2 黃花菜中粗多糖超聲提取正交因素結(jié)果

2.3 最優(yōu)條件下提取黃花菜中粗多糖含量

黃花菜在水料比1∶20、超聲功率60 Hz、提取溫度60℃、提取時(shí)間15 min條件下進(jìn)行超聲波提取，得粗多糖含量為9.67%。

2.4 黃花菜多糖的回收率試驗(yàn)結(jié)果與分析

由表3可見，黃花菜粗多糖的平均回收率為98.026%，RSD為6.98%。表明，用該方法測(cè)定黃花菜中總粗多糖含量的準(zhǔn)確度較高。

表3 黃花菜中粗多糖的回收率

3 討論

目前提取多糖的工藝有很多，具體有水煎煮法、酶法提取、超聲提取方法等。研究表明，與傳統(tǒng)的熱水浸提法相比，超聲法是利用超聲波對(duì)細(xì)胞組織的破碎作用來(lái)提高多糖提取率，具有快速、安全、簡(jiǎn)便、成本低、多糖提取率高，成分又不被破壞等優(yōu)點(diǎn)［4］。

本次實(shí)驗(yàn)超聲提取黃花菜中粗多糖時(shí)，單因素水料比，超聲頻率，提取時(shí)間，提取溫度對(duì)提取多糖影響很大。單因素水料比為1∶20時(shí)，提取率最高，繼續(xù)增加黃花菜用量，多糖的提取率反而降低，可能是因?yàn)橐恍╇s質(zhì)的析出抑制了多糖的提取。當(dāng)提取溫度到達(dá)10～15 min時(shí)，多糖的提取率很高，但是提取時(shí)間大于15 min時(shí)，多糖提取率明顯下降，說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間受熱會(huì)導(dǎo)致多糖的分解。提取溫度大于60℃后，多糖的提取率逐漸下降，可能是因?yàn)闇囟壬邔?dǎo)致部分多糖降解［5］。超聲頻率為60 Hz時(shí)，多糖提取率最高，當(dāng)超過(guò)60 Hz時(shí)，黃花菜多糖提取率逐漸下降，可能由于超聲頻率過(guò)快，導(dǎo)致多糖被破壞，所以黃花菜的粗多糖提取頻率應(yīng)該設(shè)置在60 Hz為宜。

綜合考慮上述單因素對(duì)黃花菜粗多糖提取的影響，以黃花菜中粗多糖含量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法，優(yōu)選黃花菜中粗多糖的最佳提取工藝條件。結(jié)果表明，最佳超聲提取條件為:水料比1∶20，超聲功率60 Hz，提取溫度60℃，提取時(shí)間15 min，在此工藝條件下多糖的提取率為9.67%。

［1］Uezu E.A philological and experimental investigation of the effects of Hemerocallis as food in man and ddY mice［J］.Bull Coll Educ Univ Ryukyus，1997，54:231-238.

［2］鄧放明，尹 華，李精華，等.黃花菜應(yīng)用研究現(xiàn)狀與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)對(duì)策［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2003，29(6):529-532.

［3］周啟升，劉訓(xùn)理，段祖安.植物多糖的研究與開發(fā)應(yīng)用進(jìn)展［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2010，36(3):465-469.

［4］朱曉霞，羅學(xué)剛.多糖提取與純化技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28(3):186-188.

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The extraction of polysaccharide of Hemerocallis fulva by the supersonic method

BAI Xue-song，DU Juan，DU Ze-hui (Department of Nutrition，Jilin Medical College，Jilin City，Jilin Province，132013，China)

ObjectiveTo study the extraction technology and contents of the polysaccharide from the hemerocallis fulva.MethodsThe polysaccharide of hemerocallis fulva were obtained by series steps of degreasing oligosaccharides，supersonic extraction，alcohol precipitation，trichloroacetic acid treatment and so on.According to the single factor experiment and orthogonal test，the optimum conditions for supersonic extraction of polysaccharide from the hemerocallis fulva were determined.The content of polysaccharides in hemerocallis fulva was determined by the method of phenol-sulfuric acid.ResultsThe orthogonal test showed that supersonic power was 60 Hz，extraction time was 10min，extraction temperature was 60 ℃ and the ratio of material to water was 1∶20.The extraction percent of polysaccharides from hemerocallis fulva was 9.67%.ConclusionCompared with traditional methods，supersonic extraction of polysaccharide can save time and increase the contents.

∶Hemerocallis fulva;polysaccharide;supersonic extraction;orthogonal test

TQ461

A

1673-2995(2012)05-0270-04

白雪松(1978－)，男(滿族)，講師，碩士.

2012-03-14)