金邊祛風(fēng)飲對(duì)膠原型關(guān)節(jié)炎大鼠細(xì)胞因子的影響

代玉芳，袁 林，姜錦林，蘇林沖，向詩(shī)非，向 陽(yáng)

湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院風(fēng)濕免疫實(shí)驗(yàn)中心(湖北 恩施 445000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種慢性免疫性疾病，以關(guān)節(jié)損毀為特f征，病因及發(fā)病機(jī)理尚未完全明了，治療困難，一直是風(fēng)濕病學(xué)界長(zhǎng)期以來(lái)研究的熱點(diǎn)[1]。已經(jīng)證實(shí)中藥對(duì)RA有肯定療效，由恩施民間經(jīng)驗(yàn)方組成的金邊祛風(fēng)飲，是湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院治療風(fēng)濕痹癥的經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)過(guò)多年臨床運(yùn)用用于治療RA療效明確[2-3]，但其治療機(jī)制的報(bào)道目前較少。本實(shí)驗(yàn)觀察金邊祛風(fēng)飲對(duì)膠原型關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠血清中TNF-α、IL-1β、MMP-3含量的影響，旨在探討金邊祛風(fēng)飲對(duì)RA可能的治療作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及造模Wistar大鼠，雄性，體重(200±20)g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005。將Ⅱ型膠原溶入0.1 mol/L乙酸中，完全溶解后和0.1 mol/L的不完全弗氏佐劑充分乳化，最終濃度為8 mg/ml，除正常組外每只大鼠于左后足皮下注射0.1 ml，1周后加強(qiáng)免疫1次，共15 d。各組大鼠在至炎后8 h開(kāi)始出現(xiàn)足腫脹，于18 h后達(dá)高峰，90%出現(xiàn)肉眼關(guān)節(jié)腫脹，以左后肢為主，X線下可見(jiàn)軟組織嚴(yán)重腫脹。血清酶標(biāo)檢驗(yàn)；有Ⅱ型膠原抗體存在，大部分大鼠均出現(xiàn)深部?jī)?nèi)臟風(fēng)濕結(jié)節(jié)。膝關(guān)節(jié)病理：對(duì)照組關(guān)節(jié)面腔隙內(nèi)軟組織可見(jiàn)大量的梭形成纖維細(xì)胞，組織稀疏、水腫， 并見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞和一些淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管充血明顯，并有紅血球滲出。空白組：組織和細(xì)胞排列規(guī)則，無(wú)明顯炎癥反應(yīng)。

1.2藥物及試劑①金邊祛風(fēng)飲含金邊七、雪里見(jiàn)、見(jiàn)血飛、香血藤、人血草、穿山龍、破血丹、赤芍、竹節(jié)參等藥物，由湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院制劑室提供，每毫升含生藥2 g，將其原液的臨床用藥等效劑量作為高劑量，按4∶2∶1確定高、中、低劑量，加蒸餾水配制成中、低劑量藥液備用，高、中、低劑量組給藥量均按人與大鼠體表面積系數(shù)比確定。②Ⅱ型膠原：美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：9007-34-5；③不完全弗氏佐劑：美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：Lot# I0909；④冰醋酸：成都科龍化工試劑廠，批號(hào)：20070922；⑤MTX：上海信宜藥廠有限公司，批號(hào)：20070530；⑥IL-1β、TNF -α、MMP-3酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒：上海西唐生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及給藥 60只Wistar大鼠分為6組，正常組、模型組、金邊祛風(fēng)飲高劑量組(金高組)、金邊祛風(fēng)飲中劑量組(金中組)、金邊祛風(fēng)飲低計(jì)量組(金低組)、MTX對(duì)照組，每組10只。高、中、低劑量藥物造模后組大鼠均按1 ml/(100 g·d)劑量灌胃，正常組和模型組灌服生理鹽水，金高組、金中組、金低組分別灌服相應(yīng)濃度金邊祛風(fēng)飲藥液；MTX組按1 mg/kg/w劑量腹腔注射。

1.3.2 CIA大鼠關(guān)節(jié)炎腫脹評(píng)分 按參考文獻(xiàn)[4] 采用0-4級(jí)關(guān)節(jié)評(píng)分法。0分：無(wú)關(guān)節(jié)炎；1分：小趾關(guān)節(jié)輕度腫脹；2分：小趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹；3分：踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹：4分：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)全部關(guān)節(jié)腫脹；給藥前為觀察點(diǎn)1，以后每周1次。共4次。

1.3.3 CIA大鼠病理切片 大鼠脫臼處死后將病變關(guān)節(jié)去皮毛和多余的皮下組織，切割成適當(dāng)大小的組織塊后，采用10%中性甲醛固定，10%硝酸液脫鈣，按照常規(guī)石蠟切片法切片，HE染色，Nikon顯微鏡下觀察。

1.3.4 ELISA法測(cè)定IL-1β、TNF-ɑ、MMPs-3 將大鼠脫臼處死后心臟取血，離心，取血清。按照試劑盒提供的說(shuō)明書操作。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按細(xì)胞濃度為1×103/mL，100 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板，3～4 h細(xì)胞貼壁后予以補(bǔ)液至200 μL。培養(yǎng)24 h后，吸棄懸浮細(xì)胞。每孔中加入LPS(5 mg/ml)刺激細(xì)胞24 h后，加入終濃度為(低劑量)2.6 mmol/L、(中劑量)3.0 mmol/L、(高劑量)3.4 mmol/L分別處理細(xì)胞24 h、48 h、72 h，收集上清。采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、TNF-ɑ、MMPs-3水平。

2 結(jié)果

2.1金邊祛風(fēng)飲對(duì)CIA大鼠膝關(guān)節(jié)病理學(xué)改變的影響正常組大鼠滑膜及關(guān)節(jié)面未見(jiàn)病變，滑膜襯里層由1-2層滑膜細(xì)胞組成且部分不連續(xù)， 滑膜襯里下層則為脂肪細(xì)胞和血管，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞及膠原纖維，骨和軟骨破壞圖(圖1)。對(duì)照組滑膜充血、水腫及少量單核細(xì)胞、漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，淋巴濾泡形成，小區(qū)淺表性滑膜細(xì)胞壞死而形成的糜爛，并覆有纖維素樣沉積物(圖2)。模型組大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織腫脹，滑膜細(xì)胞增大，數(shù)量增多，滑膜下明顯炎癥，可見(jiàn)血管翳形成?；そM織內(nèi)結(jié)締組織中血管充血，毛細(xì)血管明顯增多，纖維組織疏松，可見(jiàn)較多的慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)軟骨可見(jiàn)大小不等的片狀壞死灶，邊緣不整(見(jiàn)圖3)。金邊祛風(fēng)飲3個(gè)劑量治療組上述病變均程度不同的較關(guān)節(jié)炎對(duì)照組為輕，以金高組最為明顯，主要表現(xiàn)在關(guān)節(jié)軟組織內(nèi)炎細(xì)胞數(shù)量減少；少見(jiàn)血管翳形成、滑膜細(xì)胞較完整、關(guān)節(jié)軟骨破壞、邊緣不整(見(jiàn)圖4)。金低組治療組滑膜襯里下炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，充血、水腫不明顯，局部有乳頭狀增生，見(jiàn)圖5。金中組治療組局灶性滑膜細(xì)胞增生明顯，可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞為主，部分區(qū)域滑膜下纖維組織增生(見(jiàn)圖6)。

2.2金邊祛風(fēng)飲對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)的影響與正常組相比較，給藥前其余各組指數(shù)均明顯增高(P<0.01)；給藥第 2周時(shí)，各治療組指數(shù)低于模型組，其中金高組與模型組有顯著性差異 (P<0.05)；給藥第3、4周時(shí)，除金低組外各治療組改善狀況更加明顯，與模型組比較，金中組和MTX組的指數(shù)均有差異(P<0.05)，金高組有顯著性差異(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.3金邊祛風(fēng)飲對(duì)CIA大鼠血清中TNF-α、IL-1β、MMP-3含量的影響從表2可以看出，模型組與正常組相比較，IL-1β、TNF-α、MMPs-3水平均有明顯升高(P<0.01)；其它4組IL-1β、TNF-α、MMPs-3水平有不同程度的降低，其中金中組有顯著性差異(P<0.05)，MTX組、金高組均有極顯著性差異(P<0.01)。

正常組 ×200倍 圖1 對(duì)照組 ×200倍 圖2

模型組 ×100倍 圖3 金高組 ×200倍 圖4

金低組 ×200倍 圖5 金中組 ×200倍 圖6

表1 CIA大鼠給藥后不同時(shí)期關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)測(cè)定

注：與正常組相比較，△P<0.01；與模型組比較**P<0.01，*P<0.05。

表2 血清IL-1β、TNF-α、MMP-3的測(cè)定

注：與正常組比較，△P<0.01；與模型組比較**P<0.01，*P<0.05

3 討論

現(xiàn)代研究認(rèn)為RA中的滑膜細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞處于高度活化狀態(tài)，可合成IL-1β與TNF-α等多種炎性細(xì)胞因子，致使骨關(guān)節(jié)產(chǎn)生紅腫熱痛等炎癥反應(yīng)[5]。其中IL- 1β主要由單核/巨噬細(xì)胞分泌，可促使成骨細(xì)胞或骨襯里細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞表面分子，促進(jìn)破骨細(xì)胞的吸收，是目前公認(rèn)的RA核心性細(xì)胞因子[6]；TNF-α由滑膜細(xì)胞以自分泌和旁分泌的方式表達(dá)，可促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)釋放，介導(dǎo)關(guān)節(jié)滑膜產(chǎn)生持久的炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損害，它不僅可以作為藥物治療的“藥靶”，還能夠反映RA的嚴(yán)重性與活動(dòng)性[7]。MMP-3能夠溶解破壞軟骨基質(zhì)，是導(dǎo)致軟骨降解的最重要的蛋白酶，在RA患者的血液和滑膜組織中均存在著MMP-3過(guò)度表達(dá)，MMP-3可作為反映病情活動(dòng)指標(biāo)和監(jiān)測(cè)軟骨破壞程度指標(biāo)[8]。

從本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型外觀及病理切片結(jié)果看，金邊祛風(fēng)飲各劑量組均可以有效緩解CIA大鼠的關(guān)節(jié)腫脹度，并表現(xiàn)出相應(yīng)的量效關(guān)系，其中高劑量組的效果還優(yōu)于MTX對(duì)照組?？赡苁且?yàn)榻疬呾铒L(fēng)飲作用于關(guān)節(jié)皮下軟組織及滑膜組織，有效地減輕其充血和水腫程度。同時(shí)，金邊祛風(fēng)飲各劑量組均降低TNF-α、IL-1β、MMPs3水平，也表現(xiàn)出相應(yīng)的量效關(guān)系，其中高劑量組與MTX對(duì)照組的效果為最好?？赡苁且?yàn)榻疬呾铒L(fēng)飲作用于滑膜組織，使得RA中的滑膜細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的高度活化狀態(tài)得以有效控制，從而使滑膜細(xì)胞、巨噬細(xì)胞所分泌下游炎性細(xì)胞因子的水平下降。其中巨噬細(xì)胞減少IL-1β的分泌，從而遏制炎癥的始動(dòng)因素，減緩破骨細(xì)胞的過(guò)度吸收，減低對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的破壞；滑膜細(xì)胞降低TNF-α的分泌，即可以減低炎癥介質(zhì)的釋放，從而阻斷炎癥反應(yīng)；滑膜細(xì)胞降低MMPs3的分泌，既可以阻止軟骨基質(zhì)的崩解，還可減緩微血管基底膜和間質(zhì)成分的降解，從而避免血管翳的形成。這可能就是金邊祛風(fēng)飲治療RA的作用機(jī)制之一。

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