高效液相色譜法測定黑木耳中還原型谷胱甘肽的含量

韓玲，黃成澤，張小勇

（延邊大學分析測試中心，吉林 延吉133002）

高效液相色譜法測定黑木耳中還原型谷胱甘肽的含量

韓玲，黃成澤，張小勇＊

（延邊大學分析測試中心，吉林 延吉133002）

優(yōu)化溶劑提取、分離條件，并利用高效液相色譜法測定了野生和栽培黑木耳中的還原型谷胱甘肽（GSH）含量.結(jié)果表明：野生木耳和栽培木耳均含有較高的GSH，其中野生木耳的GSH含量（2.354 5 mg／g）高于栽培木耳（1.148 0 mg／g），這可能與其生長環(huán)境有關；木耳可作為一種重要的外源性GSH來源的食用菌.

食用菌；黑木耳；谷胱甘肽；液相色譜法；生物活性

0 引言

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是存在于動植物和微生物細胞內(nèi)的一種生物活性三肽，由L－谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成.由于GSH具有抗氧化、抗衰老、抗癌等重要的生物活性功能，因此被廣泛應用在醫(yī)藥、保健等領域［1－4］.隨著人們對GSH的生物活性功能的進一步了解，篩選富含GSH的藥食兩用植物或菌屬類作為外源性GSH補充劑來防病、治病受到人們的極大關注［5－6］.目前制備GSH的生產(chǎn)工藝是菌類生物合成法［7－8］，這意味著天然生長的菌類可能富含GSH和具備最佳GSH生物合成的化學環(huán)境.黑木耳（Auricularia auricula）是延邊地區(qū)特色產(chǎn)品之一，食味鮮美、營養(yǎng)豐富，是具有很高實用價值的藥食兩用菌類.吳瑞憲［9］對黑木耳的營養(yǎng)成分進行了研究，發(fā)現(xiàn)黑木耳中富含蛋白質(zhì)、碳水化合物和各種維生素類以及鈣、磷、鐵等人體必需的宏量和微量元素.目前，對黑木耳中的活性成分的研究大多集中在碳水化合物中的活性多糖類.研究［10－11］表明，黑木耳中的多糖不僅具有抗凝血、抗腫瘤、抗炎癥等作用，還具有降低血脂、血糖、血液黏度、膽固醇以及抗糖尿病、抗衰老、抗輻射，促進核酸、蛋白質(zhì)的生物合成和防治多種老年性疾病等功效.關于黑木耳中活性肽GSH的含量測定及其相關生物活性功能的研究未見報道.本文采用溶劑提取法和高效液相色譜法測定了黑木耳中GSH的含量，并發(fā)現(xiàn)黑木耳中富含GSH.

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

儀器：Agilent1100－1946A液質(zhì)聯(lián)用儀（HP），液相色譜（配有在線二極管陣列DAD紫外檢測器），超聲波清洗器（天津奧特賽儀器有限公司As2120B），RE－52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），TDL－60B離心機（上海安亭科學儀器廠）.

試劑：谷胱甘肽（Sigma），樣品處理過程中所用試劑（三氟乙酸、乙醇、丙酮、磺基水楊酸、三氯乙酸、甲酸、乙酸）均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水，色譜溶劑甲醇和三氟乙酸均采用色譜純試劑，GSH的對照品是新鮮配制的溶液.精密稱取4.000 mg GSH和GSSG標準品，置于20 m L容量瓶中，用稀鹽酸（0.1 mol／L）溶解，搖勻后定容至刻度，分別得到0.20 mg／m L GSH和GSSG的對照品溶液.

1.2 實驗材料和樣品處理

黑木耳為野生和人工栽培的干品，采摘時間均不足1年.分別稱取已干燥研磨成細粉的黑木耳干品0.30 g，加入25 mL 0.10 mol／L HCl，超聲40 min，過濾.濾液加入2倍體積的甲醇，5 000 r／min離心8 min，除去蛋白后上清液移到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1／3的體積，用0.45μm微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液.

1.3 液相色譜儀器的測定條件

色譜柱為 Capcell Pak C18柱（5μm，2.0×150 mm），流動相為水（含0.1%三氟乙酸）－甲醇＝98∶2（體積比），流速為0.2 mL／min，柱溫為5℃，紫外檢測波長選為200 nm（實驗發(fā)現(xiàn)該波長處GSH和GSSG具有較強的吸收），進樣量為5μL.

1.4 色譜流動相的選擇

實驗中分別采用不同配比的甲醇－甲酸、甲醇－乙酸和甲醇－三氟乙酸作為流動相對供試品樣品進行測定.發(fā)現(xiàn)在 MeOH－HCOOH、MeOHCH3COOH流動相體系中，GSH的保留值很小，易與供試品中的氨基酸等低保留組分的色譜峰重疊.當采用0.1%CF3COOH－MeOH＝98∶2（體積比）的流動相時，GSH的保留時間有效提高，并且減小了與供試品中低保留組分的重疊，分辨率增加.這可能是流動相中的三氟乙酸是較強的離子對試劑，由于在酸性環(huán)境下GSH帶正電荷，它易與洗脫液中的三氟乙酸負離子生成電中性的離子對，使其易于在非極性柱上保留，進而提高了GSH的保留時間.

1.5 蛋白沉淀劑的選擇

實驗中用0.39 mol／L 5－磺基水楊酸、0.61 mol／L三氯乙酸等強酸和丙酮、乙醇、乙腈、甲醇等有機溶劑分別對植物樣品的鹽酸提取液進行除蛋白處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶液均變?yōu)榛鞚幔@表明有蛋白質(zhì)的析出.對處理液進行高速離心分離，上清液再用微孔濾膜過濾，濾液用液相色譜進行測定.結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論用強酸，還是用有機溶劑進行除蛋白處理，在色譜測定區(qū)域都出現(xiàn)了較寬的響應譜帶，對分析測定產(chǎn)生了影響，這可能是溶劑在200 nm處都有吸收的緣故.利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（40℃水浴）把除蛋白處理的溶液在低溫下蒸發(fā)，可全部去除其中的有機溶劑，消除其所引起的干擾.由于流動相中有甲醇，且其沸點低易揮發(fā)，因此本文最終選定甲醇為蛋白沉淀劑（甲醇2倍體積于樣品提取液）.

2 結(jié)果和討論

2.1 黑木耳供試品中GSH的定性分析

為了便于對供試品中的GSH色譜峰進行定性，首先在上述優(yōu)化的色譜條件下取適量的GSH標準溶液（0.20 mg／mL），然后進行色譜測定，結(jié)果見圖1.如圖1所示，GSH的保留時間為5.4 min.

圖1 GSH的色譜圖

圖2為在同樣的條件下測定野生和栽培木耳提取液的色譜圖，其中A和B分別為野生和栽培木耳樣品的色譜圖，C和D分別為野生和栽培樣品中加入0.02 mg／m L GSH標樣后的色譜圖.圖2表明，經(jīng)除蛋白處理的野生和供試品溶液，在保留時間5.4 min附近都可以觀察到GSH色譜峰.其中：野生木耳的色譜峰干擾較少，基本能夠達到基線分離；栽培木耳共存組分的干擾較大，未達到基線分離.這說明栽培木耳和野生木耳的組成成分存在差異（可能是樣品中的氨基酸或多元醇）.當黑木耳供試品中加入標準的GSH溶液時，GSH的色譜峰明顯增大，說明該色譜峰可能為GSH的色譜峰.為了進一步定性色譜峰，利用液質(zhì)聯(lián)用儀測定了GSH的標準溶液的質(zhì)譜圖和野生黑木耳提取液中GSH的離子流圖（圖3）.

圖3顯示，GSH在電噴霧質(zhì)譜圖上具有靈敏的質(zhì)譜響應，并且黑木耳提取液在保留時間5.7 min附近具有明顯的GSH的離子流，這說明黑木耳中保留值5.7附近的色譜峰是GSH的色譜峰.

圖2 色譜圖

圖3 GSH的質(zhì)譜圖和野生黑木耳提取液在m／z 306處的離子流圖

2.2 GSH的色譜定量分析

圖4為利用色譜外標法測定GSH的校正曲線.圖4表明，色譜峰的面積與選定的GSH濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系，其線性回歸方程為A＝0.627＋39 452.92C，相關系數(shù)R＝0.999 9.表1數(shù)據(jù)為外表法測定木耳中GSH的含量.數(shù)據(jù)表明，野生木耳中GSH的含量明顯高于栽培的木耳.利用該方法測定GSH的回收率分別達到94.90%和94.45%，3次測定的標準偏差分別為2.49%和2.52%，基本滿足準確分析要求.

圖4 GSH含量和色譜峰面積的校正曲線

表1 木耳樣品中GSH含量的測定結(jié)果

3 結(jié)論

1）黑木耳中富含GSH，干品野生木耳的GSH含量為2.354 5 mg／g，干品栽培木耳的GSH含量為1.148 0 mg／g，這表明木耳可作為一種重要的外源性GSH來源的食用菌，其豐富的營養(yǎng)價值和生物學功能可能與其富含GSH有關.

2）野生木耳中的GSH含量高于栽培木耳的GSH含量，說明GSH可能在木耳生長環(huán)境抗逆性中起重要作用，即野生種適應在低溫、干旱的逆環(huán)境中生長可能與其含有較高的GSH含量有關［12］.

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［3］Balendiran G K，Dabur R，F(xiàn)raser D.The role of glutathione in cancer［J］.Cell Biochem Funct，2004，22：343－352.

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［12］陳坤明，宮海軍，王鎖民.植物谷胱甘肽代謝與環(huán)境脅迫 ［J］.西北植物學報，2004，24（6）：1119－1 1 3 0.

Determination of reduced glutathione inAuriculariaauriculaby HPLC

HAN Ling，HUANG Cheng－ze，ZHANG Xiao－yong＊
（AnalysisandInspectionCenter，YanbianUniversity，Yanji133002，China）

The optimal extraction solvent and isolation condition for Reduced Glutathione（GSH）in wild and cultivatedAuriculariaauriculais investigated，furthermore，the GSH content is determined by High Performance Liquid Chromatography（HPLC）method.The results shows that both the wild and the cultivatedAuriculariaauriculacontains higher GSH content，i.e.，the wildAuriculariaauriculais 2.354 5 mg／g on a dry weight basis，the cultivated is 1.148 0 mg／g.The cause of the higher GSH content for the wildAuricularia auriculaseem related to growing environment.It shows theAuriculariaauriculashould become an important edible fungus for exogenous GSH.

edible fungi；Auriculariaauricula；glutathione；HPLC；bioactivity

R151.3

A

1004－4353（2012）01－0071－04

2011－11－05

＊通信作者：張小勇（1970—），男，實驗師，研究方向為色譜分析.