桑蟬止咳方提取工藝初步試驗研究*

徐靜逍, 羅曉麗, 李晉玉, 崔 濤, 畢 云, 熊麗娟

(1.云南中醫(yī)學院, 云南 昆明 650500； 2.云南省藥物研究所, 云南 昆明 650101； 3.昆明醫(yī)學院, 云南 昆明 650031)

桑蟬止咳方由桑葉、木蝴蝶等組成，具有疏散風熱，利咽止咳等功效，為治療燥熱型咳嗽的有效經(jīng)驗方，其活性成分大多溶于乙醇和水，因此筆者選用醇-水雙提法以達到能最大限度提取方中有效成分的目的。本實驗主要研究醇提部分的提取工藝，用正交實驗法對影響提取工藝的醇濃度、醇用量、提取時間、提取次數(shù)等因素進行考察，以桑葉中的蘆丁、木蝴蝶中的黃芩苷的轉(zhuǎn)移率為工藝考察指標，通過正交試驗結(jié)果計算影響該試驗的主次因素，再結(jié)合生產(chǎn)實際確定優(yōu)化的工藝參數(shù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters1525色譜儀Agilent 1200。

1.2 試藥

1.2.1 試劑 提取用的乙醇為醫(yī)用乙醇，含量測定用的甲醇、乙腈、均為色譜純，冰乙酸(國藥集團化學試劑有限公司)、磷酸(重慶川東有限公司化學試劑廠)醋酸銨(上海試四赫維化工有限公司)均為分析純，配制溶劑用的水為自制超純水。

1.2.2 對照品 綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110753-200212)，黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110715-200815)。

1.2.3 藥材 該提取工藝所用桑葉、木蝴蝶等藥材均購于云南省藥材公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 醇提部分的正交實驗

2.1.1 醇提正交實驗設計 根據(jù)前述各味藥材所含成分及藥理研究基礎，按處方量稱取藥材，選取影響提取的幾個主要因素醇濃度、醇用量、提取次數(shù)、提取時間為考察因素，每個因素設立如下表1的3個水平。

采用L9(34)正交表安排實驗，按正交條件進行乙醇回流提取，濾過，濾液回收乙醇后再濃縮至小體積，置于水浴鍋上烘至稠浸膏后置于真空烘箱中烘干。

2.1.2 各項指標測定方法 醇提干浸膏得率：按處方量稱取藥材，以L9(34)正交表設計的順序各加入設定的乙醇用量，按規(guī)定的時間和次數(shù)回流提取，濾過，合并濾液，回收乙醇后濃縮成浸膏，置真空烘箱中減壓干燥至干浸膏，稱重計算干浸膏得率。

綠原酸、黃芩苷含量的測定：照高效液相色譜法(《中國藥典》2005版一部附錄Ⅵ D)測定[1]。

2.1.3 高效液相色譜法對綠原酸、黃芩苷含量的測定結(jié)果 供試藥品、對照品溶液的制備及色譜條件：

桑葉藥材：精密稱取桑葉藥材100.7 mg，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱重，超聲提取30 min放冷后再稱重，補足損失溶劑量，濾過，取續(xù)濾液，用0.45 um的微孔濾膜濾過備用，濃度為4.028 mg/mL。

綠原酸：取在105℃干燥至恒重的綠原酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL中含0.024 mg的溶液即得。

儀器：Agilent1200/007色譜儀；色譜柱：Waters SymmetryshieldTMRP18柱(4.6 mm*250 mm，5 um)；流動相：甲醇-0.5%磷酸水溶液(18：82)；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：350 nm；進樣量：10 uL。

用該法測定的綠原酸對照品、桑蟬樣品、陰性對照品的HPLC圖譜見圖1～圖3。

圖1 綠原酸標準品

圖2 桑蟬樣品

圖3 缺桑葉空白樣品

木蝴蝶藥材：精密稱取木蝴蝶藥材219.4 mg,置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱重，超聲提取30 min放冷后再稱重，補足損失溶劑量，濾過，取續(xù)濾液，用0.45 μm的微孔濾膜濾過備用，濃度為8.776 mg/mL。

黃芩苷：取在105℃干燥至恒重的綠原酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL中含0.11 mg的溶液即得。

儀器：Agilent1200/007系列色譜儀；色譜柱：Waters SymmetryshieldTMRP18柱(4.6 mm*250 mm,5 μm)；流動相：甲醇(A)-0.5%磷酸水溶液(B)梯度洗脫，[0-32 min,A (40-40);32-35 min,A (40:45);35-40(45-45)〗；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：316 nm；進樣量：10 μl。

用該法測定的黃芩苷對照品、桑蟬樣品、陰性對照品的HPLC圖譜見圖4～圖6。

圖4 黃芩苷標準品

圖5 桑蟬樣品

圖6 缺木蝴蝶空白樣品

2.2 各指標成分測定及計算結(jié)果 根據(jù)高效液相色譜法測定所得各指標成分的峰面積值，計算L9(34)正交表項下各指標成分的轉(zhuǎn)移率，轉(zhuǎn)移率的計算公式為：

轉(zhuǎn)移率= 相應藥材提取含量*提取物量/藥材含量*藥材量

轉(zhuǎn)移率一般是50%以上。

結(jié)果見表2～表3。

表2 綠原酸轉(zhuǎn)移率計算結(jié)果

表3 黃芩苷轉(zhuǎn)移率計算結(jié)果

2.3 正交試驗結(jié)果分析 見表4～表5。

表4 醇提工藝正交實驗結(jié)果統(tǒng)計

綜合評分M=綠原酸轉(zhuǎn)移率/綠原酸轉(zhuǎn)移率最大值*30%+黃芩苷轉(zhuǎn)移率/黃芩苷轉(zhuǎn)移率最大值*15%+其他藥材65%。

表5 醇提工藝正交試驗方差分析表

正交試驗結(jié)論：以綜合評分為標準，直觀分析表明，在所選因素水平范圍內(nèi)，各因素作用順序為提取次數(shù)>提取時間>醇用量>醇濃度，最佳提取方案A2B3C3D3，而方差分析結(jié)果表明因素A(醇濃度)、因素B(醇用量)、因素C(提取次數(shù))因素D(提取時間)對實驗結(jié)果均無顯著影響(P>0.05)。由于各因素的統(tǒng)計學檢驗不具有顯著性，且醇提取后還要進行水提，為降低成本，故將醇提工藝定為A2B2C2D2，即取藥材量8倍的70%乙醇回流提取2次，每次2 h。

2.4 醇提驗證試驗 為了進一步考察優(yōu)選工藝的可靠性及穩(wěn)定性，取3份按處方量稱取的藥材，按醇提正交試驗所得提取工藝即取藥材量8倍的70%乙醇回流提取2次，每次2 h進行驗證試驗，測定結(jié)果見表6。

表6 醇提驗證試驗結(jié)果

從表6可看出，驗證實驗結(jié)果與正交表中最優(yōu)實驗組結(jié)果相當，指標成分的轉(zhuǎn)移率都在50%以上，說明該優(yōu)選工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

桑蟬止咳方為多味藥組成的復方，眾所周知中藥復方成分眾多且復雜，為保證提取工藝的可控性，我們采用了高效液相色譜對多個有效指標性成分含量測定的定量控制方法，該方法具有可控性好，準確程度高的特點；而且多指標綜合評價提取工藝較以往的單指標評價方法更為全面，但是中藥復方的優(yōu)勢在于眾多成份協(xié)同作用，以達到多靶點多方位治療疾病的目的，因此否能有效治療疾病并非簡單的將各指標成分疊加，還應結(jié)合藥理和和藥效等方面的試驗，才能進一步確定方劑的功效。

本醇提正交實驗以綜合評分為標準，直觀分析結(jié)果表明，在所選因素水平范圍內(nèi)，各因素作用順序為：提取次數(shù)C>提取時間B>醇用量A>醇濃度，最佳提取方案為最佳提取方案A2B3C3D3，而方差分析結(jié)果表明因素A(水用量)、B(提取時間)、C(次數(shù))對實驗結(jié)果均無顯著影響(P>0.05)。醇提取后還要進行水提，為降低成本，故將醇提工藝定為A2B2C2D2，即取藥材量8倍的70%乙醇回流提取2次，每次2 h，經(jīng)醇提正交驗證實驗證明該工藝是穩(wěn)定和可行的。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：化學工業(yè)出版社，2005：附錄Ⅵ D.