Duffy血型研究及臨床應(yīng)用新進(jìn)展

蘇宇清，梁延連，張印則，宋 騁

(深圳市血液中心,廣東 深圳 518035)

Duffy血型研究及臨床應(yīng)用新進(jìn)展

蘇宇清，梁延連，張印則，宋 騁

(深圳市血液中心,廣東 深圳 518035)

Duffy血型是人類最重要的血型系統(tǒng)之一，Duffy血型不僅僅與輸血安全及母嬰血型不合引起的新生兒溶血病密切相關(guān)，Duffy抗原作為趨化因子還在人類瘧疾瘧原蟲受體、炎癥、腫瘤、移植排斥等方面發(fā)揮著重要作用。本文從Duffy抗原表達(dá)和基因結(jié)構(gòu)、Duffy血型在人群中的分布、Duffy血型的檢測方法、Duffy血型生物學(xué)功能及臨床應(yīng)用等方面，綜述國內(nèi)外關(guān)于Duffy血型研究與臨床應(yīng)用的現(xiàn)狀及最新進(jìn)展。

Duffy血型；基因多態(tài)性；表現(xiàn)頻率；臨床應(yīng)用

Duffy血型是于1950年，在一名因多次輸血導(dǎo)致溶血反應(yīng)的患者血清中，由Cusbush等人發(fā)現(xiàn)抗Fya抗體，由于該患者姓Duffy，故稱該血型為Duffy血型。一年后,Ikin等發(fā)現(xiàn)了與Fya抗原相對應(yīng)的Fyb抗原。1995年，國際輸血協(xié)會(ISBT)將Duffy血型系統(tǒng)編號為008[1]。近年來，隨著社會科技的不斷發(fā)展，紅細(xì)胞Duffy血型檢測因其在臨床應(yīng)用中的重要意義而倍受關(guān)注，最新研究表明，Duffy血型不僅僅與輸血安全及母嬰血型不合引起的新生兒溶血病相關(guān)，Duffy抗原作為趨化因子還在人類瘧疾瘧原蟲受體、炎癥、腫瘤、移植排斥等方面發(fā)揮著重要作用。本文就Duffy血型血清學(xué)、基因、功能檢測以及臨床應(yīng)用等方面的研究進(jìn)行綜述。

1 Duffy抗原表達(dá)和基因結(jié)構(gòu)

Duffy血型系統(tǒng)共有6個抗原，即Fya(001)，F(xiàn)yb(002)，F(xiàn)y3(003)，F(xiàn)y4(004)，F(xiàn)y5(005)和 Fy6(006)， 其中最重要的是Fya與Fyb抗原。Fya與Fyb抗原都是在胎兒出生時就已經(jīng)完全發(fā)育，并且在胎兒很小時的紅細(xì)胞上Fya及Fyb抗原就已和成人紅細(xì)胞上的表達(dá)一樣強了[2]。Duffy抗原不僅能在紅細(xì)胞上表達(dá)，而且均能在全身毛細(xì)血管后微靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以及小腦浦肯野細(xì)胞表面等發(fā)現(xiàn)，就算是陰性個體Fy(a-b-)在骨髓中檢測不到Duffy的mRNA也能表達(dá)于腦、肝臟以及腸等器官上[3]。

Duffy血型抗原是位于細(xì)胞膜表面的糖蛋白，分子質(zhì)量為35000～50000，是一種趨化因子受體[4](Duffy Antigen Receptor for Chemokines,DARC)，其成熟蛋白是α螺旋7次跨膜，N端在細(xì)胞外，C端在細(xì)胞內(nèi)[5]，屬于G蛋白偶聯(lián)家族。Fya和Fyb對多數(shù)蛋白水解酶敏感，經(jīng)木瓜蛋白酶、無花果酶、菠蘿酶、鏈霉蛋白酶和胰蛋白酶處理的紅細(xì)胞能夠完全破壞Fya和Fyb抗原，而胰島素不能破壞Fya和Fyb的活性[6]，唾液酸酶處理的紅細(xì)胞對Duffy抗原沒有任何影響[7]。

Chaudhuri等[8]首次克隆了FY cDNA,而后人們進(jìn)一步證明了編碼Duffy血型的基因位于常染色體1q22-q23，具有2個外顯子，且被1個479bp的內(nèi)含子分隔，編碼336個或338個氨基酸，形成3個主要等位基因FYA、FYB和FY(沉默基因)。其中FYA與FYB等位基因分別編碼Fya和Fyb抗原，它們區(qū)別為cDNA第125個核苷酸是否有單堿基G變A，致使氨基酸第42位上的編碼產(chǎn)物Gly變Asp[9]，從而產(chǎn)生了多態(tài)性FYA和FYB，而且還在FYA序列中產(chǎn)生了一個BanI酶切位點。另一個等位基因FY為沉默基因，決定Duffy陰性表現(xiàn)型Fy(ab-)，F(xiàn)y(a-b-)紅細(xì)胞上缺乏Duffy的糖蛋白，F(xiàn)Y的編碼序列與FYB的等位基因基本相同，其區(qū)別在于基因啟動區(qū)里有一個突變T33C，這一突變正好位于GATA序列上，即CTTATCT到CTTACCT，這使得紅系GATA1轉(zhuǎn)移因子的結(jié)合被破壞，使該基因在紅細(xì)胞上表達(dá)受阻[10]，但這不影響它在其他細(xì)胞上的表達(dá)。

2 Duffy血型在人群中的分布

除了人體骨髓中，在肺、肌肉、脾、結(jié)腸、心臟、胰腺、腎臟和腦中均能檢測到Duffy mRNA。使用抗Fya和抗Fyb抗血清檢測人類紅細(xì)胞，能將Duffy血型的表現(xiàn)型分為 Fy(a+b-)、Fy(a+b+)、Fy(a-b+)、Fy(a-b-)。Duffy血型表現(xiàn)型在不同人種中分布有很大區(qū)別如表1[11]所示，F(xiàn)y(a-b+)血型在歐洲人及非洲人種中的表現(xiàn)頻率顯著高于亞洲日本人，而Fy(a-b-)表現(xiàn)型是沉默基因FY的純合子的產(chǎn)物，在美洲黑人和非洲黑人，其FYA及FYB頻率有區(qū)別，但是其FY沉默基因的頻率與歐洲人比則要高，非洲黑人Fy(a-b-)表現(xiàn)型達(dá)90%以上，然而Fy(a-b-)血型在白種人和其它人種中非常罕見。而中國人的Fya的表現(xiàn)頻率為99%，F(xiàn)yb則為9.2%[12]，綜合國內(nèi)報道表現(xiàn)頻率和基因頻率如表2所示，其中華北漢族人群Fy(a-b+)和Fy(a-b-)表現(xiàn)型的頻率顯著高于中國其他地區(qū)。

表1 歐洲人、非洲人及亞洲日本人Duffy血型表現(xiàn)頻率

表2 中國部分地區(qū)Duffy分布表現(xiàn)型頻率及基因頻率

3 Duffy血型的檢測方法

目前，Duffy血型的檢測方法有很多，如血清學(xué)表型檢測、基因檢測及功能檢測等。Fya和Fyb抗原數(shù)量分別為 13000～14000，F(xiàn)ya和Fyb對多數(shù)蛋白水解酶敏感，經(jīng)木瓜蛋白酶、無花果酶、菠蘿酶等處理的紅細(xì)胞能完全破壞其Fya和Fyb抗原，因此不能使用酶法檢測Duffy血型抗原，而是利用相應(yīng)血清抗體做間接抗球蛋白及其它促凝介質(zhì)實驗來加以鑒定。此外，利用 Fya、Fyb、Fy6、Fy3 單克隆抗體對其相應(yīng)的Duffy血型抗原做流式細(xì)胞儀分析,估算紅細(xì)胞上Duffy抗原位點數(shù)[13]。也可以通過紅細(xì)胞膜分離的糖蛋白進(jìn)行免疫印跡法檢測Duffy抗原數(shù)量的變化[14]。國內(nèi)外建立了一種酶聯(lián)免疫競爭法來檢測Duffy抗原活性、病中變化規(guī)律及臨床意義用以研究DARC蛋白作為趨化因子受體的生物學(xué)功能。

通過對Duffy血型基因結(jié)構(gòu)，F(xiàn)YA、FYB及FY等位基因堿基變化的了解，設(shè)計了以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)用以判斷其基因型。常用的基因檢測方法是PCR-SSP，可以利用4條特異性引物來對Duffy基因定型，即2條分別針對C-33(FY)或T-33(FYA或FYB)正向引物和2條反向引物G125(FYA)或A125(FY或FYB)，它們中任意組合，而當(dāng)FY、FYA和FYB任何一個存在時則其擴增產(chǎn)物約為700bp。

G125A的替代在造成FYA和FYB的多態(tài)性的同時，也在FYA等位基因中產(chǎn)生一個BanI酶切位點，而在FY和FYAB的多態(tài)性T-33C替代中，也使FY等位基因產(chǎn)生一個StyI酶切位點。結(jié)合兩種多態(tài)性位點，使用PCR-RFLP法,用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對PCR擴增片段進(jìn)行消化，根據(jù)消化后的片段長度可判斷基因型。

Duffy血型基因型的PCR-SSP法雖然簡單，但由于FYA和FYB等位基因特異性引物只相差1個堿基，因此特異性擴增產(chǎn)物易出現(xiàn)假陽性[15]。PCR-RFLP法檢測Duffy血型基因也同樣存在這些問題,且難以同時檢出FYA、FYB及FY基因型.解決以上問題的最佳方法是通過建立Duffy血型基因的DNA基因測序技術(shù)，通過對做Duffy基因編碼區(qū)域及基因啟動區(qū)域序列進(jìn)行測序,可以準(zhǔn)確了解Duffy血型基因結(jié)構(gòu)，為Duffy血型的分子生物學(xué)研究提供了更精準(zhǔn)的技術(shù)平臺。

4 Duffy血型生物學(xué)功能及臨床應(yīng)用

Duffy血型在臨床安全輸血中具有重要的意義，Duffy血型抗體可以由多次妊娠引起，但大多數(shù)是由于輸血而產(chǎn)生，也曾報道發(fā)生2例 “天然產(chǎn)生”的抗Fyb[16]。歐洲人中抗-Fyb是一個相對稀有的抗體，它的抗體產(chǎn)生頻率通常是抗Fya的1/20。中國人中抗-Fya抗體的產(chǎn)生相對罕見，陳忠，張莉尼[17]曾報道121份溶血性輸血反應(yīng)不規(guī)則抗體，只有1例抗-Fya。與輸血反應(yīng)密切相關(guān)的Duffy抗原有Fya及Fyb，抗-Fya與抗-Fyb能引起速發(fā)型或遲發(fā)型溶血性輸血反應(yīng)，雖然大多數(shù)只是輕微的反應(yīng)，但一些急性反應(yīng)仍是致命的，所以如若檢查到了其相應(yīng)抗體則必須輸陰性血液[18]。Duffy血型抗體還可以引起新生兒溶血病，一般癥狀比較輕，偶爾也非常嚴(yán)重，需進(jìn)行光療法及宮內(nèi)輸血。Duffy抗原不易保存，就算是冷凍抗原也會減弱，只能用特殊抗凝劑保存，故常需要利用Duffy基因定型來篩選與之相符的表現(xiàn)型的血液。

引起人類瘧疾的瘧原蟲以間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲最為常見。Duffy血型抗原是間日瘧原蟲的受體[19]。在幾十年以前人們就知道了大多的黑人都不會感染間日瘧原蟲，而黑人大多數(shù)都是表現(xiàn)型為Fy(a-b-)。Miller等首次報道了當(dāng)表型為Fy(ab-)時可不受間日瘧感染[20]。讓11名黑種人和6名白種人志愿者有感染間日瘧原蟲的機會，只有表現(xiàn)型是Fy(a-b-)的5名黑種人未感染瘧疾，其他的人都被感染了，在有247人都是表現(xiàn)型為Fy(a-b-)的420名洪都拉斯人中，有14人受間日瘧原蟲的感染，但受感染的人的表現(xiàn)型都不是Fy(a-b-)。

最新研究表明，Duffy抗原還是紅細(xì)胞趨化因子，命名為Duffy抗原/趨化因子受體(Duffy antigen/receptor for chemokine,DARC)。通過超微結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)間日瘧原蟲與Duffy抗原陽性紅細(xì)胞的對接區(qū)雙脂質(zhì)層下有一電子密度結(jié)構(gòu) (牢固結(jié)合點),間日瘧原蟲能于此處與DARC緊密結(jié)合從而入侵紅細(xì)胞，這種結(jié)構(gòu)對于其入侵紅細(xì)胞很有必要，由于Fy(a-b-)型的個體缺乏DARC，從而能抵抗瘧原蟲裂殖子的入侵。Singh等[21]設(shè)計了一種可以使得大腸埃希菌表達(dá)一個Duffy蛋白功能區(qū)域，該區(qū)域能與間日瘧原蟲結(jié)合。

Duffy抗原作為趨化因子受體，能與多種前炎癥趨化因子結(jié)合，趨化因子趨動細(xì)胞因子參與多項細(xì)胞事件，特別是白細(xì)胞活化和募集[22]。Duffy抗原的DARC蛋白是一種清除受體，其主要是能清除血循環(huán)中的趨化因子[23]。而許多的趨化因子含量在炎癥的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)化中具有很大的影響。因此，DARC能參與到炎癥的調(diào)節(jié)中。無論是Duffy陽性的人還是非洲的Fy(a-b-)的人，Duffy糖蛋白在體內(nèi)許多的細(xì)胞上都有表達(dá)。在被感染了HIV腎病的小孩的腎臟組織里，人們檢測出了Duffy糖蛋白存在適度的上調(diào)，則可能是由于Duffy糖蛋白在腎炎里有一定作用[24]。

Duffy抗原與腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移和許多事件相關(guān)，而趨化因子及其受體也在這些事件中起到作用[25]。腫瘤的轉(zhuǎn)移為具有高度組織性的非隨機性及器官選擇性的多步驟過程。表達(dá)Duffy抗原可以抑制腫瘤的成瘤性和轉(zhuǎn)移。例如，Duffy抗原/趨化因子對于乳腺癌是一個負(fù)性調(diào)控因子，其清除促血管性趨化因子的作用對于抑制腫瘤的進(jìn)展是很重要的，通過Woolley[26]等應(yīng)用流式細(xì)胞的方法檢測紅細(xì)胞表面的Duffy抗原的數(shù)量以及Horuk[27]等研究的紅白血病細(xì)胞，顯示可以通過紅細(xì)胞清除很多成瘤性的趨化因子，從而降低乳腺癌細(xì)胞的趨化運動，削弱癌轉(zhuǎn)移的能力,國內(nèi)有研究表明Duffy表型多態(tài)性與乳腺癌的關(guān)系，F(xiàn)y（a-）表型對于發(fā)現(xiàn)潛在的腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者有幫助[28]。

Duffy抗原與移植排斥的相關(guān)性，Akalin E等[29]研究163名非裔美國人腎移植患者的Duffy抗原狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，與白人相比，非裔美國人發(fā)生急性移植排斥反應(yīng)的比例較高而移植存活率較低，Duffy各表型之間的差異無顯著性，但Fy(a-b-)患者移植物衰竭與延遲排斥反應(yīng)高度相關(guān)，說明DARC可作為趨化因子清除槽減低延遲排斥反應(yīng)(DGF)過程中的炎癥反應(yīng)，而DARC陰性患者表型為DGF易損傷。

美國Loma Linda大學(xué)的Subburaman Mohan博士及其同事在《基因組研究》(Genome Res，2007)中報告，Duffy抗原基因多態(tài)性似乎可引起骨礦密度變化，并可能影響個體骨質(zhì)疏松癥風(fēng)險。

從最初發(fā)現(xiàn)了Duffy抗原與臨床輸血安全及新生兒溶血病之間的關(guān)系，到證明其抗原是人類瘧原蟲受體及雜性趨化因子受體，隨著對Duffy血型的不斷研究，我們對Duffy抗原的功能以及分子結(jié)構(gòu)有了更深入的了解，對于相關(guān)疾病的診斷、治療及預(yù)防具有重要的指導(dǎo)作用。

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R457.1+1

A

1674-1129(2012)05-0452-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.05.011

蘇宇清，女，1968年10月出生，主任技師，專業(yè)：輸血醫(yī)學(xué)