檢測(cè)PML/RARα基因的雙重?zé)晒舛縋CR方法的建立

江梅,萬臘根,簡正偉,石淙,張長林

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌330006)

檢測(cè)PML/RARα基因的雙重?zé)晒舛縋CR方法的建立

江梅,萬臘根,簡正偉,石淙,張長林

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌330006)

目的建立在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)融合基因PML/RARα和內(nèi)參基因ABL的雙重?zé)晒舛縋CR方法。方法從DNA聚合酶含量、Mg2+濃度和引物濃度等方面進(jìn)行優(yōu)化，建立檢測(cè)PML/RARα和ABL基因雙重?zé)晒舛縋CR體系，從分析靈敏度，批內(nèi)、批間精密度以及檢測(cè)臨床樣本陽性率等方面對(duì)雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系進(jìn)行性能評(píng)價(jià)，并同時(shí)和北京思爾成公司熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行比較，分析兩者的一致性。結(jié)果成功構(gòu)建雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系，檢測(cè)質(zhì)粒靈敏度為103copies/ml，檢測(cè)NB4細(xì)胞的靈敏度為10-3，反應(yīng)體系批內(nèi)、批間精密度Ct值的變異系數(shù)CV都小于5%，檢測(cè)20例確診為APL病人，其檢測(cè)陽性率，和北京思爾成公司的PCR反應(yīng)試劑一致。結(jié)論成功開發(fā)出穩(wěn)定的雙重?zé)晒舛縋CR試劑盒，其操作簡單，成本低，誤差小，能夠有效地用于APL分子生物學(xué)分型診斷、用藥指導(dǎo)、預(yù)后觀察及MRD監(jiān)測(cè)。

熒光定量PCR；PML/RARα；ABL；急性早幼粒細(xì)胞白血病

急性早幼粒細(xì)胞白血病 (acute promyelocytic leukemia，APL)是較為常見的急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia，AML) 的一種特殊類型[1]。研究表明，98%以上的APL病人出現(xiàn)非隨機(jī)的染色體易位 t(15；17)(q22；q21)，造成 PML、RARa 基因重排而形成PML/RARα融合基因[2]，該融合基因在APL白血病的發(fā)生中起關(guān)鍵作用，同時(shí)也成為APL特異性的分子標(biāo)志。因此對(duì)APL病人PML/RARα融合基因的檢測(cè)成為APL分子生物學(xué)分型診斷、用藥指導(dǎo)、預(yù)后觀察及微小殘留病 (minimal residual disease，MRD)診斷的重要技術(shù)手段[3]。 臨床上檢測(cè)PML/RARα融合基因的方法很多，最常用的是熒光定量RT-PCR，為了實(shí)現(xiàn)操作簡單，成本低，誤差小，本研究擬在已有的工作基礎(chǔ)上，建立在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)PML/RARα和ABL的雙重?zé)晒舛縋CR方法，該方法在一個(gè)反應(yīng)體系中檢測(cè)兩個(gè)基因，這樣可以減少試劑用量，同時(shí)減少操作步驟，大大減少實(shí)驗(yàn)成本和實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料 RPMI-1640培養(yǎng)基、D-Hanks、FBS購于 Hyclone公司、Trizol、DNA Marker為天根公司產(chǎn)品、RT試劑盒、RNA酶抑制劑為TaKaRa公司產(chǎn)品、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購于北京思爾成生物技術(shù)有限公司、Tap DNA Polymerase購自Fermentas公司、dNTP和人淋巴細(xì)胞分離液購自Solarbio公司、E.coli DH5α 和質(zhì)粒 PCMV4-PML/RARα-ABL為本室自藏。NB4細(xì)胞由上海交通大學(xué)血液學(xué)研究所惠贈(zèng)。

1.1.2 主要儀器 電泳儀、凝膠成像儀購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司、湘儀H-1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購自上海科學(xué)器材有限公司、細(xì)胞培養(yǎng)箱為TherMo、熒光定量PCR儀ABI7300購于美國ABI公司、紫外分光光度儀購自BIO-RAD公司。

1.1.3 臨床病例 以FAB分型為基礎(chǔ)診斷的急性早幼粒細(xì)胞白血病初治患者4名,化療形態(tài)學(xué)完全緩解患者16名，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照急性白血病FAB分型[4],以及1名健康志愿者，抽取患者以及志愿者的骨髓液2ml加到肝素抗凝管中。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人NB4細(xì)胞株培養(yǎng) 按文獻(xiàn)培養(yǎng)NB4細(xì)胞[5]。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和合成 PML/RARα基因引物序列和探針序列：根據(jù)PML/RARα的融合位點(diǎn)，軟件Primer Premier 1.0設(shè)計(jì)檢測(cè)PML/RARα融合基因的引物和探針，上游引物在PML上，下游引物在RARa上，擴(kuò)增片段為122 bp，引物序列和探針序列如下：上游引物(FP)為:5’-ccg tca tag gaa gtg agg tct-3’ 、下游引物(RP)為:5’-ggc tgg gca cta tct ctt ca-3’、探針(PP)為：5’-ctg ctc tgg gtc tca atg gct gcc tcc-3’，用FAM標(biāo)記；ABL基因引物序列和探針序列：檢測(cè)ABL的引物，為了避免基因組的污染，在設(shè)計(jì)上跨外顯子，我們?cè)谠O(shè)計(jì)ABL引物是上游引物在3號(hào)外顯子上，下游引物在4號(hào)外顯子上，擴(kuò)增的目的片段長120bp，引物序列和探針序列如下：上游引物(FA)為：5’-tcc atc tcg ctg aga tac gaa g-3’ 、下游引物(RA)為：5’-atg atg aac caa ctc ggc ca-3’、探針(PA)為：5’-caa cac tgc ttc tga tgg caa gct cta cg-3’，用VIC標(biāo)記。引物和探針均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 單重及雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系的建立

1.2.3.1 退火溫度 通過定性PCR技術(shù)優(yōu)化檢測(cè)PML/RARa和ABL的溫度條件，特別是退火溫度，獲得一個(gè)既能擴(kuò)增出PML/RARα，又能擴(kuò)增出ABL的條件。

1.2.3.2 Mg2+濃度 固定反應(yīng)體系中其余試劑成分不變，Mg2+濃度梯度遞增進(jìn)行單重?zé)晒舛縋CR，尋找最佳的Mg2+濃度。

1.2.3.3 引物濃度 固定反應(yīng)體系中其余試劑成分不變，引物濃度梯度遞增進(jìn)行單重?zé)晒舛縋CR，尋找最佳的引物濃度。

1.2.3.4 通過Mg2+和引物濃度梯度擴(kuò)增，尋找出最佳的Mg2+和引物濃度，建立本研究的單重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系，并在此基礎(chǔ)上建立雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系。

1.2.4 單重及雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系性能評(píng)價(jià)

1.2.4.1 反應(yīng)體系分析靈敏度評(píng)價(jià) (1)檢測(cè)質(zhì)粒的靈敏度 將PCMV4-PML/RARα-ABL質(zhì)粒按10倍比例進(jìn)行梯度稀釋成各個(gè)梯度拷貝數(shù)，然后用本實(shí)驗(yàn)室建立的單重和雙重?zé)晒舛縋CR方法進(jìn)行檢測(cè)，以能夠出現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的最低質(zhì)粒濃度為反應(yīng)體系的檢測(cè)下限。(2)檢測(cè)NB4細(xì)胞的靈敏度①分離人骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)抽取2ml正常人骨髓液加到肝素抗凝管中。取一支10ml的無菌離心管，加入2ml的人淋巴細(xì)胞分離液，再將抽取的2ml骨髓液小心加在等量的淋巴細(xì)胞分離液上，室溫中，水平離心1500r/min 15min。此時(shí)離心管中形成5層，小心吸取中間的白膜層，用7～10倍體積的0.01mol/L D-Hanks液稀釋洗滌,1500r/min離心15min，洗 滌2～3次,去上清夜，再用少許DHanks液重懸，牛鮑計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度。分裝6管細(xì)胞，每管根據(jù)濃度定量為106個(gè)細(xì)胞數(shù)。②分別在6管含106個(gè)正常骨髓單個(gè)核細(xì)胞中加入不同量的 NB4 細(xì)胞(106，105，104，103，102，101)，然后提取RNA，用Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，紫外分光光度儀檢測(cè)RNA的濃度和純度，為逆轉(zhuǎn)錄體系RNA的定量做準(zhǔn)備。RT體系為：5×PrimeScriptTMBuffer 2μl、PrimeScriptTMRT Enzyme Mix 1 0.5μl、Oligo dTPrime (50μM)0.5μl、Random 6 mers(100μM)0.5μl Total RNA 0.4～0.5μg RNase Free dH2O 補(bǔ)齊至10μl。RT 反應(yīng)條件：37℃ 15min 85℃5s。獲取cDNA，再以cDNA為模板,然后用本實(shí)驗(yàn)室建立的單重和雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)，以能夠在106個(gè)背景細(xì)胞中出現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的最小NB4細(xì)胞數(shù)為本試劑的臨床靈敏度。靈敏度=NNB4×10-6。

1.2.4.2 反應(yīng)體系精密度的評(píng)價(jià) (1)批內(nèi)精密度評(píng)價(jià)：分別取高(108copies/ml)、中(106copies/ml)、低(104copies/ml)三個(gè)濃度的質(zhì)粒，每個(gè)濃度的質(zhì)粒采用單重和雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系重復(fù)檢測(cè)5次，分別計(jì)算出高、中 低三個(gè)濃度的Ct值的平均值()，標(biāo)準(zhǔn)差(s)，以及變異系數(shù)(CV)，評(píng)價(jià)反應(yīng)體系的批內(nèi)精密度。(2)批間精密度評(píng)價(jià)：分別取高(108copies/ml)、中(106copies/ml)、低(104copies/ml)三個(gè)濃度的質(zhì)粒，每個(gè)濃度的質(zhì)粒采用單重和雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系連續(xù)檢測(cè)5d，分別計(jì)算出高、中 低三個(gè)濃度的Ct值的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差以及變異系數(shù)，評(píng)價(jià)反應(yīng)體系的批間精密度。

1.2.4.3 檢測(cè)臨床樣本陽性率一致性的評(píng)價(jià) Trizol法提取病人骨髓液總RNA，RT后獲取cDNA，再以cDNA為模板,然后用本實(shí)驗(yàn)室建立的雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系以及北京思爾成生物技術(shù)有限公司的熒光定量PCR反應(yīng)試劑進(jìn)行檢測(cè)，比較兩者檢測(cè)臨床樣本陽性率。北京思爾成生物技術(shù)有限公司實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：PML/RARα-L反應(yīng)液和ABL反應(yīng)液各8μl,混合酶液各2μl,cDNA 15μl，總體系為 25μl。 ABI7300 擴(kuò)增儀擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5min，94℃變性 15s，60℃退火/延伸60s，共40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 單重及雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系的建立根據(jù)優(yōu)化好的最佳退火溫度、Mg2+濃度和引物濃度，確立單重及雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系單重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系:10×Reaction Buffer 2.5μl、dNTP(2.5mM)2.5μl、Mg2+(25mM)8μl、FP/FA(40μM)0.5μl 、RP/RA (40μM)0.5μl、PP/PA(10μM)0.5μl、Tap DNA Polymerase(5U/μl)0.5μl、Sterile ddH2O 1μl、質(zhì)粒模板 PCMV4-PML/RARα-ABL 9μl、總體系 25μl。 RQ-PCR 擴(kuò)增體系: 預(yù)變性 94℃ 2min ，94℃ 30s 、53℃ 30s、72℃ 30s 40個(gè)循環(huán)。

雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系：10×Reaction Buffer 2.5μl、dNTP(2.5mM)2.5μl、Mg2+(25mM)8μl、FP (40μM)0.5μl、FA (40μM)1μl、RP (40μM)0.5μl、RA(40μM)1μl、PP(10μM)0.5μl、PA(10μM)0.5μl、Tap DNA Polymerase(5U/μl)0.5μl、質(zhì)粒模板 PCMV4-PML/RARα-ABL 7.5μl、總體系 25μl。RQ-PCR擴(kuò)增體系:預(yù)變性 94℃2min，94℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 30s 40個(gè)循環(huán)。

2.2 單重及雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系性能評(píng)價(jià)

2.2.1 反應(yīng)體系分析靈敏度評(píng)價(jià)

2.2.1.1 質(zhì)粒靈敏度 本實(shí)驗(yàn)室建立的單重和雙重?zé)晒舛縋CR方法(反應(yīng)體系如上述所示)進(jìn)行檢測(cè)，能夠檢測(cè)到的最低質(zhì)粒濃度都為103copies/ml，103copies/ml以下濃度未能檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào)，其Ct值與以上不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)數(shù)值擬合作圖得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，Ct值和模板起始濃度對(duì)數(shù)值之間具有較好的線性關(guān)系r2≥0.99。見圖1。

圖1 PML/RARα和ABL濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線(雙重?zé)晒舛縋CR方法)

2.2.1.2 檢測(cè)NB4細(xì)胞的靈敏度 本實(shí)驗(yàn)室建立的單重和雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)，能夠出現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的最小NB4細(xì)胞數(shù)為103，靈敏度=NNB4×10-6=103×10-6=10-3，6 管細(xì)胞中， 能夠出現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的最小NB4細(xì)胞數(shù)為103個(gè)，NB4細(xì)胞數(shù)為102,101個(gè)未能檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào)，故本擴(kuò)增體系的臨床靈敏度=103×10-6=10-3。也就是1000個(gè)正常的背景細(xì)胞中只要有1個(gè)APL細(xì)胞就能檢測(cè)到。

單重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系和雙重?zé)晒舛縋CR的檢測(cè)NB4細(xì)胞靈敏度一致，能夠出現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的最小NB4細(xì)胞數(shù)都為103個(gè)(圖略)。

2.2.2 反應(yīng)體系精密度評(píng)價(jià)

2.2.2.1 單重和雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系批內(nèi)精密度評(píng)價(jià) 如表1所示高、中、低三個(gè)濃度的質(zhì)粒，無論是單重還是多重?zé)晒舛縋CR，其Ct值的變異系數(shù)CV都小于5%，故批內(nèi)精密度好，試劑批內(nèi)重復(fù)檢測(cè)較為穩(wěn)定。

2.2.2.2 單重和雙重?zé)晒舛縋CR方法批間精密度評(píng)價(jià)如 表2所示高、中、低三個(gè)濃度的質(zhì)粒，無論是單重還是多重?zé)晒舛縋CR，其Ct值的變異系數(shù)CV雖比批內(nèi)精密度要大，但也都小于5%，故批間精密度較好，試劑批間重復(fù)檢測(cè)較為穩(wěn)定。

表1 批內(nèi)精密度評(píng)價(jià)表

表2 批間精密度評(píng)價(jià)表

2.2.3 檢測(cè)臨床樣本陽性率一致性的評(píng)價(jià) 雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系檢測(cè)確診為20例APL病人(4例初治，16例形態(tài)學(xué)完全緩解病人)，其檢測(cè)臨床樣本陽性率，和北京思爾成生物技術(shù)有限公司的單重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)試劑一致。兩試劑盒的比較結(jié)果見表3。

表3 雙重?zé)晒舛縋CR體系和思爾成試劑盒檢測(cè)樣本結(jié)果的比較

20 位病人中，4例初治病人PCR結(jié)果均為陽性，其余16例病人，檢測(cè)到4例陽性。其余12例未能檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào)。即初治病人檢測(cè)的陽性率是100%，MRD的病人陽性檢出率為25%,圖略。

用北京思爾成生物技術(shù)有限公司的單重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)試劑對(duì)這20例病人的mRNA進(jìn)行檢測(cè)(圖略)，思爾成試劑盒和雙重PCR檢測(cè)結(jié)果總符合率為100%，陽性檢出率為40%，陰性檢出率為60%，Kappa值為1，表示結(jié)果完全一致。故本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的雙重體系能夠用于臨床診斷急性早幼粒白血病，且能對(duì)PML/RARα融合基因的拷貝數(shù)進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，在用藥指導(dǎo)、預(yù)后觀察及MRD診斷方面發(fā)揮重要作用。并且該方法在一個(gè)反應(yīng)體系中檢測(cè)兩個(gè)基因，可以減少試劑的用量，同時(shí)減少操作步驟和操作誤差，大大減少實(shí)驗(yàn)成本和實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

3 討論

在進(jìn)行單重及雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系設(shè)計(jì)時(shí)，主要從四個(gè)關(guān)鍵因素考慮：(1)Mg2+濃度，Mg2+是Taq DNA聚合酶活性所必需的,酶的量一般2U足夠進(jìn)行定量PCR,最重要的是酶的活性，而Mg2+濃度除影響酶活性外,也影響引物的退火,模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度,產(chǎn)物的特異性,引物二聚體的形成等。Mg2+濃度過低時(shí),酶活力明顯降低;過高時(shí),酶可催化非特異性擴(kuò)增，故Mg2+濃度是要優(yōu)化的關(guān)鍵因素。(2)引物濃度，適當(dāng)?shù)囊餄舛瓤梢蕴岣叻磻?yīng)體系的靈敏度，但是不能過高，否則也會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。(3)退火溫度，合適的退火保證所有引物同等雜交。過高時(shí)，可能無法擴(kuò)增出目的條帶，過低時(shí)，會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。(4)Hot-start策略：本實(shí)驗(yàn)沒有使用熱啟動(dòng)酶，為了降低實(shí)驗(yàn)成本，采取人工熱啟動(dòng)的辦法，即加樣以及上機(jī)之前都是在冰盒中操作以使酶活性最低。Mg2+濃度，引物濃度，退火溫度都進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化，且擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量分析后，上樣于1.5%瓊脂糖凝膠平板電泳上，結(jié)果只見目的條帶和少量的引物二聚體(圖略)，未見其它非特異性擴(kuò)增，故Mg2+濃度，引物濃度，退火溫度基本已優(yōu)化到最佳。

本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的單重以及雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系臨床性能評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，兩者在質(zhì)粒靈敏度，檢測(cè)NB4細(xì)胞的靈敏度，批內(nèi)批間精密度上都無明顯差異，而雙重反應(yīng)體系以其減少試劑的用量，減少操作步驟和實(shí)驗(yàn)的時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)能夠更好地用于臨床診斷。本實(shí)驗(yàn)室收集了20例APL的病人，分別用雙重?zé)晒舛縋CR和市面上的單重試劑進(jìn)行檢測(cè)，診斷陽性率一致，故本實(shí)驗(yàn)成功開發(fā)出了穩(wěn)定的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒。

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Establishment of duplex real-time PCR method for PML/RARα fusion gene detection

JIANG Mei,WAN Lagen,JIAN Zhengwei,et al.Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China

ObjectiveTo establish a duplex real-time quantitative PCR method for respective detection of PML/RARα fusion gene and ABL gene in one reaction system.MethodsWe optimized the method from several aspects,such as DNA polymerase concentration,Mg2+concentration,primer concentration and so on after its establishment.The reaction performance of duplex real-time quantitative PCR system was assessed mainly from the analysis sensitivity,within-run precision,between-run precision,and positive rate in clinical samples detection.Additionally,the method was also compared with Beijing Siercheng biological limited company's PCR reagent kit and the consistency was analyzed between them.ResultsWe established duplex realtime quantitative PCR reaction system successfully.The detection sensitivities of plasmid and NB4 cell were 103copies/ml and 10-3,respectively.The CV values of within-run,between-run precision and Ct value were all less than 5%.The positive rate was in agreement with Beijing Siercheng biological Limited company's PCR reagent kit when we detected 20 APL patients using the method.ConclusionWe have successfully developed a stable duplex real-time quantitative PCR reagent kit with advantages as simple operation,low cost,and low inaccuracy.It can be effectively used for APL molecular typing diagnosis,medication guide,prognosis and MRD monitoring.

Real-time quantitative PCR；PML/RARα； ABL； Acute promyelocytic leukemia

R733.7,R73-35+

A

1674-1129(2012)05-0433-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.05.005

江西省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目,編號(hào)20111022

江梅，女，1986年出生,畢業(yè)于南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，碩士研究生，檢驗(yàn)醫(yī)師，專業(yè)是臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)，主要從事血液學(xué)分子診斷的研究。