堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子提高人工血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附性的實(shí)驗(yàn)研究

朱錦輝 裘華森

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,浙江 杭州 310006)

人工血管是重要的血管移植物,已被廣泛地用于血管重建。但在人工血管置換病變的靜脈和口徑小于6mm的動(dòng)脈時(shí),常因腔內(nèi)血栓形成而閉塞。其主要原因是人工血管不具備與自體血管相同的內(nèi)膜和內(nèi)皮細(xì)胞(EC)。研究表明,在人工血管內(nèi)壁種植內(nèi)皮細(xì)胞,使其早期快速內(nèi)皮化,可以改善移植血管的通暢性[1],但種植的單層內(nèi)皮細(xì)胞往往粘附力差,在血流的沖擊下容易脫落[2]。提高內(nèi)皮細(xì)胞的黏附性有著重要意義。本研究采用bFGF預(yù)處理人工血管用再種植內(nèi)皮細(xì)胞,以期提高內(nèi)皮細(xì)胞的保存率。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 3月齡新西蘭白兔6只,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 內(nèi)皮細(xì)胞取自人大隱靜脈,用標(biāo)準(zhǔn)酶分離技術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)[1]。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中,在培養(yǎng)液中加入含lacZ基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,使內(nèi)皮細(xì)胞事先載入lacZ基因,可通過X-gal染色確認(rèn)內(nèi)皮細(xì)胞。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體保存于293T/17包裝細(xì)胞(美國(guó)ATCC公司),采用含10%胎牛血清(杭州四季青生物有限公司)和2mol/L的DMEM 131培養(yǎng)基(Hyclone公司)包裝細(xì)胞,并擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

1.2.2 人工血管 選用聚四氟乙烯人工血管(PTFE)(IMPRA,Inc·,AZ)6根,內(nèi)徑 4mm,試驗(yàn)組3根經(jīng)bFGF溶液(北京鑫琪百奧公司)預(yù)襯處理,即在人工血管腔內(nèi)加壓灌注bFGF溶液(0.1 mg/mL),直至外壁出現(xiàn)“冒汗”現(xiàn)象;對(duì)照組3根人工血管不予處理。

1.2.3 細(xì)胞種植 兩組人工血管內(nèi)分別注入內(nèi)皮細(xì)胞懸浮液(3×105cells/mL),二端加熱封閉,在37℃條件下,以每10分鐘1次轉(zhuǎn)動(dòng)人工血管共2小時(shí),使細(xì)胞均勻附著排列于內(nèi)壁。然后剪開封閉口,將此人工血管放入DMEM 131培養(yǎng)液中孵育24小時(shí)。使內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)壁黏附生成完成細(xì)胞種植。

1.2.4 體內(nèi)灌注試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)用3月齡新西蘭白兔隨機(jī)分為2組,每組各3只,取EC種植的人工血管2/3段植入兔腹主動(dòng)脈,采用血管旁路方式,術(shù)中注意避免損傷人工血管內(nèi)壁上的細(xì)胞,手術(shù)前后給予適當(dāng)抗凝劑,術(shù)后應(yīng)用甲基潑尼松龍抑制急性排斥反應(yīng),植入2小時(shí)后取出觀察。

1.2.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)檢查 體內(nèi)灌注前后各取人工血管標(biāo)本3段,縱形剖開,磷酸緩沖液輕柔漂洗,10%甲醛固定,X-半乳糖苷染色顯示種植的內(nèi)皮細(xì)胞,相差顯微鏡(40倍)計(jì)數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞,每段隨機(jī)取10個(gè)視野計(jì)數(shù),共30個(gè)視野,計(jì)算其平均值。

2 結(jié) 果

細(xì)胞種植后內(nèi)皮細(xì)胞密度觀察 對(duì)照組未經(jīng)任何預(yù)襯處理的人工血管,細(xì)胞種植成功率低,內(nèi)皮細(xì)胞密度僅為(167±14)cell/mm2。試驗(yàn)組經(jīng)bFGF預(yù)襯處理的人工血管,內(nèi)皮細(xì)胞種植后,人工血管內(nèi)壁內(nèi)皮細(xì)胞密度達(dá)到(364±19)cells/mm2,見表1。

體內(nèi)循環(huán)灌注實(shí)驗(yàn) 在兔腹主動(dòng)脈灌注2小時(shí)后,人工血管內(nèi)種植的細(xì)胞均有脫落現(xiàn)象,其中單純內(nèi)皮細(xì)胞種植組71%細(xì)胞脫落,而bFGF預(yù)襯處理EC種植組僅有38%內(nèi)皮細(xì)胞脫落,該種植組細(xì)胞保存率達(dá)62%,明顯高于單純內(nèi)皮細(xì)胞種植組29%(P＜0.01),見表1。

表1 灌注前后人工血管腔面種植細(xì)胞密度和保存率比較±s)

表1 灌注前后人工血管腔面種植細(xì)胞密度和保存率比較±s)

與對(duì)照組比較**P＜0.01

組 別 n 細(xì)胞數(shù)(cells/mm2)灌流前 灌流后保存率(%)對(duì)照組 30 167±14 48±19 29±14試驗(yàn)組 30 364±19 226±27 62±22**

3 討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞具有防止血液凝固和血栓形成的作用,并且內(nèi)皮愈合能夠減輕吻合口內(nèi)膜增生程度。人工血管腔面內(nèi)皮細(xì)胞種植和早期快速內(nèi)皮化有利于維持管腔通暢[2]。但是由于種植的內(nèi)皮細(xì)胞黏附性差,容易被血流沖脫,實(shí)際應(yīng)用效果不佳[3]。因此,提高內(nèi)皮細(xì)胞的粘附性有著重要意義,目前主要途徑有:(1)預(yù)襯纖維結(jié)合素等細(xì)胞外基質(zhì)[4];(2)人工血管表面進(jìn)行化學(xué)修飾,摻入RGD等特異性的細(xì)胞附著肽鏈序列[5]。這些方法顯示了一定的作用,但效果欠佳,不能普遍應(yīng)用。

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)是一種廣泛存在于人體各種組織中的生物活性物質(zhì)。它被認(rèn)為是血管生成刺激物、成纖維細(xì)胞增殖趨化因子、成肌細(xì)胞、角膜細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的刺激物等。除了能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)上粘附和轉(zhuǎn)移外,bFGF還具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞合成ECM成分以及趨化等作用,從而有利于細(xì)胞的附著固定[6]。

本研究在內(nèi)皮細(xì)胞種植前,先用bFGF溶液預(yù)襯處理人工血管,以提高內(nèi)皮細(xì)胞的粘附性和保存率。由于體內(nèi)血管中血流方式復(fù)雜,呈脈沖性層性流動(dòng)、渦流和2次流等,對(duì)血管壁的作用很大,因此對(duì)于觀察內(nèi)皮細(xì)胞在人工血管中的粘附性是否提高有更實(shí)際的意義。本實(shí)驗(yàn)將種植內(nèi)皮細(xì)胞后的兩組人工血管分別植入兔腹主動(dòng)脈,模仿人體血流的生理狀態(tài),分析比較在復(fù)雜的血流切力作用下,bFGF預(yù)襯處理提高內(nèi)皮細(xì)胞保存率的情況。

結(jié)果顯示,未用bFGF處理的對(duì)照組,無(wú)論是種植細(xì)胞密度還是在兔腹主動(dòng)脈血流作用下的細(xì)胞保存率均低于bFGF預(yù)襯處理組,故bFGF預(yù)襯處理人工血管不僅可以明顯提高初期的種植效果,提高靜態(tài)培養(yǎng)條件下人工血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞密度,而且可以提高脈沖灌注情況下EC的保存率。

有研究表明,bFGF還能逆轉(zhuǎn)缺氧導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力下降[7]。因此,在種植細(xì)胞過程中更有效的保證了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分化,從而有利于內(nèi)皮細(xì)胞在血管表面的均勻分布。血液流動(dòng)產(chǎn)生的流體剪切應(yīng)力影響內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)和功能,內(nèi)皮細(xì)胞可通過形態(tài)變化、相關(guān)細(xì)胞粘附分子基因表達(dá)及纖維產(chǎn)生等反應(yīng),以承受高剪切應(yīng)力的需要[5]。本實(shí)驗(yàn)中bFGF預(yù)處理提高內(nèi)皮細(xì)胞在人工血管上的粘附性,其機(jī)制可能是上調(diào)了β1整合素,該整合素通過介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞間的連接和內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的信號(hào)導(dǎo)以及作為一種細(xì)胞表面手提介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與ECM的粘附,從而使細(xì)胞牢固附著在基底膜上,耐受血流切應(yīng)力的沖擊[8-9]。

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