熒光原位雜交技術(shù)在膀胱癌診斷中的臨床應(yīng)用▲

覃智標(biāo) 蒙清貴 畢革文 文亦磊 黃瑞旭

(1廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，南寧市 530023;2廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科，南寧市 530021;3廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，南寧市 530023)

熒光原位雜交技術(shù)在膀胱癌診斷中的臨床應(yīng)用▲

覃智標(biāo)1蒙清貴2畢革文1文亦磊3黃瑞旭1

(1廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，南寧市 530023;2廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科，南寧市 530021;3廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，南寧市 530023)

目的探討熒光原位雜交技術(shù)(FISH)在膀胱癌診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法對30例可疑膀胱尿路移行上皮細(xì)胞腫瘤的血尿患者的尿液標(biāo)本同時(shí)行尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測和熒光原位雜交分析，并與最終的病理學(xué)檢查結(jié)果對比。結(jié)果尿脫落細(xì)胞學(xué)的靈敏度為33.33%，特異度為100%，F(xiàn)ISH的靈敏度為85.71%，特異度為 88.89%，兩者靈敏度相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而兩者特異度相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論FISH技術(shù)在檢測膀胱移行上皮細(xì)胞癌方面具有較高的靈敏度和特異度，在膀胱癌的診斷中具有重要的臨床意義和實(shí)用價(jià)值。

熒光原位雜交;膀胱癌;細(xì)胞學(xué);診斷

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤，在我國男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中，其發(fā)病率和死亡率均占首位。早期發(fā)現(xiàn)和診斷膀胱癌對于患者的治療和預(yù)后意義重大。為避免傳統(tǒng)的侵入性檢查方法如膀胱鏡檢等給患者帶來的痛苦和尿道損傷、泌尿系感染等風(fēng)險(xiǎn)，以及針對尿脫落細(xì)胞學(xué)敏感度較底的不足，我們將熒光原位雜交技術(shù)(FISH)技術(shù)用以診斷膀胱癌，并與尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果相比較，評估FISH技術(shù)在膀胱尿路上皮癌診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 2010年1月至2012年1月收集廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院30例住院患者的尿液標(biāo)本，納入的標(biāo)準(zhǔn)為經(jīng)影像學(xué)和實(shí)驗(yàn)室檢查除外泌尿系結(jié)石及腎、輸尿管、前列腺病變和泌尿系感染等引起的血尿者。其中男性18例，女性12例，年齡24～80歲，平均(50±12)歲。

1.2 儀器和試劑 熒光原位雜交操作平臺:OLYMPUS BX51系統(tǒng)顯微鏡，OLYMPUS BX-UCB通道轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，X-cite SERIES120熒光燈，DELL微型計(jì)算機(jī)，Prog Res Capture Pro 2.5 攝像系統(tǒng)，VIDEOTEST-FISH 2.0 圖像分析處理系統(tǒng);上海躍進(jìn)SHHW 21420三用恒溫水浴箱和上海博迅HPX-9052 MBE恒溫培養(yǎng)箱，Seven Milti型 pH/電導(dǎo)率/離子綜合測試儀和常熟雙杰T 200型電子天平，長沙湘智TXZ5-WS臺式離心機(jī)。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的 FISH試劑購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司，為GLPP 16/CSP 17(紅色/綠色)和CSP 7/CSP 3(紅色/綠色)兩組。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 患者均在膀胱鏡檢查前行尿脫落細(xì)胞FISH檢測和細(xì)胞學(xué)檢查。連續(xù)3 d留取晨尿200 mL，1 h內(nèi)送檢。采用一次性使用的清潔干燥容器，注意避免標(biāo)本污染。每份尿樣分為2份，分別行尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查和FISH檢測，并將其檢測結(jié)果與最終的病理檢查結(jié)果對比。

1.3.1 FISH 檢測方法

1.3.1.1 標(biāo)本配制 新鮮尿液標(biāo)本離心后去上清液，依次加入膠原酶B 2 mL、KCl低滲溶液5 mL、甲醇固定液2 mL后離心去除上清液;加固定液5 mL，室溫靜置5 min，再次離心去上清液;加固定液5 mL重復(fù)固定1次;離心后去除上清液后滴片;室溫下過夜老化玻片。

1.3.1.2 標(biāo)本處理 用 Rnase(Sigma，0.1 g/L)和 Pepsin(Sigma，0.1 g/L)先后處理，多聚甲醛固定 15 min。PBS緩沖液洗滌后，玻片加700 ml/L甲酰胺/2xSSC(pH 7.0)溶液，72℃變性3 min，2xSSC －4℃ 3 min洗滌2次，梯度乙醇脫水，室溫晾干。

1.3.1.3 雜交 將探針加到玻片的標(biāo)本上覆蓋玻片，Rubber Cement封片后置濕盒37℃溫箱中避光雜交48 h。

1.3.1.4 洗片 除去蓋玻片，將玻片放入500 ml/L甲酰胺/2xSSC溶液，42℃洗滌 15 min。2xSSC室溫?fù)u洗3 min×2次，梯度乙醇脫水，室溫暗處晾干，加2 mL二氨基苯基吲哚(DAPI，Vysis公司)復(fù)染，封片。送熒光顯微鏡下觀察，CCD攝取圖像并進(jìn)行圖形分析統(tǒng)計(jì)。

1.3.1.5 結(jié)果判定 本研究的陽性結(jié)果判斷完全依據(jù)金菩嘉公司提供的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。分為紅色(GLPP 16和CSP 7探針)和綠色(CSP 17和CSP 3探針)兩種信號。4個探針中有2種或者2種以上的探針異常信號出現(xiàn)就可以判定為陽性結(jié)果。

1.3.2 尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查 將受檢患者的尿液標(biāo)本離心后取脫落細(xì)胞制成病理涂片，用顯微鏡進(jìn)行觀察。每例患者連續(xù)留取3 d尿液標(biāo)本做脫落細(xì)胞學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)1次癌細(xì)胞即可判定為陽性結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

以膀胱鏡和術(shù)后病理檢查結(jié)果作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，該30例患者通過膀胱鏡活檢或手術(shù)后病理檢查明確診斷為膀胱移行上皮細(xì)胞癌患者21例，膀胱良性病變9例。尿脫落細(xì)胞學(xué)的靈敏度為33.33%，特異度為100%;FISH的靈敏度為85.71%，特異度為88.89%，兩者靈敏度相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而兩者特異度相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 兩種檢測方法靈敏度及特異度比較

3 討論

目前，膀胱癌的診斷、檢測主要以膀胱鏡檢查組織活檢和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查為主。前者較直觀且準(zhǔn)確性高，但對于肉眼難辨的微小扁平腫瘤發(fā)現(xiàn)困難，易造成漏診［1］，且為有創(chuàng)性檢查，可能損傷尿道引起尿道狹窄，甚至造成假道，同時(shí)也增加了逆行尿路感染的風(fēng)險(xiǎn)，部分患者很難接受膀胱鏡檢所帶來的痛苦;后者特異性高，但對低級別腫瘤的診斷敏感性較低。目前文獻(xiàn)報(bào)道的尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測膀胱癌的敏感度為13% ～75%，特異度為85% ～100%［2］。因此，如何能夠以一種無創(chuàng)、快速的方法對膀胱癌進(jìn)行檢測，同時(shí)又能夠具有較高的敏感性和特異性，成為目前臨床上亟待解決的問題。

FISH是一種應(yīng)用熒光物質(zhì)依靠核酸探針雜交原理在核中或染色體中顯示DNA(或RNA)序列位置的方法。根據(jù)堿基互補(bǔ)配對的原則，利用已知的熒光素標(biāo)記的單鏈DNA(或RNA)與待檢材料中未知的單鏈DNA(或RNA)進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。FISH具有安全、快速、靈敏度高、檢測信號強(qiáng)、雜交特異性高、能同時(shí)顯示多種顏色等優(yōu)點(diǎn)，不僅能顯示細(xì)胞中期分裂相，還能顯示間期核［3］。作為一種新興的檢測技術(shù)，F(xiàn)ISH廣泛應(yīng)用于血液腫瘤、實(shí)體腫瘤的診斷與檢測。目前研究已證實(shí)3號、7號、9(p16)號、17號染色體的遺傳學(xué)改變與膀胱癌的早期發(fā)生及發(fā)展、復(fù)發(fā)密切相關(guān)［4］。而本組研究所采用的FISH探針則是針對以上四種染色體的。

目前國內(nèi)不少報(bào)道已指出，F(xiàn)ISH在診斷膀胱尿路上皮癌方面較尿細(xì)胞脫落學(xué)檢查具有更高的敏感性，而特異性相似［5～7］。本組研究結(jié)果顯示，尿脫落細(xì)胞學(xué)的靈敏度為33.33%、特異度為100%，F(xiàn)ISH的靈敏度為85.71%、特異度為 88.89%，兩者靈敏度相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而兩者特異度相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，與目前的研究報(bào)道結(jié)果相似。可見，F(xiàn)ISH在診斷及檢測膀胱癌方面同時(shí)具有較高的敏感度和特異度，且該方法簡便、迅速、安全，可以很好地彌補(bǔ)膀胱鏡檢及尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查的不足之處。

FISH檢測方法安全、快速，靈敏度及特異度均較高，且探針可長時(shí)間保存，可多色標(biāo)記，結(jié)果觀察簡單直觀，除用于脫落細(xì)胞檢測外，還可廣泛運(yùn)用于新鮮、冷凍或石蠟包埋標(biāo)本等多種物質(zhì)的檢測。該方法在各系統(tǒng)實(shí)體腫瘤及血液腫瘤的診斷及監(jiān)測中均可采用，具有重要的臨床實(shí)際運(yùn)用價(jià)值。

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R 737.14

B

1673-6575(2012)06-0605-03

廣西中醫(yī)藥大學(xué)重點(diǎn)科研課題(項(xiàng)目編號:2D2009004)

覃智標(biāo)(1968～)，男，本科，副主任醫(yī)師，研究方向:FISH技術(shù)在膀胱癌的診斷應(yīng)用。

2012-08-11

2012-10-27)