利用序批式生物膜反應(yīng)器啟動(dòng)厭氧氨氧化研究

于英翠,高大文,陶 彧,陳春宏 (.哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱50090；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,陜西 楊凌 7200)

厭氧氨氧化菌以 NO2--N作為電子受體,直接將氨氮氧化為氮?dú)?厭氧氨氧化與傳統(tǒng)的硝化反硝化相比,是一種更為高效且經(jīng)濟(jì)的脫氮方式,不僅能夠節(jié)省50%以上能源和100%的有機(jī)碳源,還可以減少溫室氣體的排放[1-2].近幾年來(lái)厭氧氨氧化菌富集培養(yǎng)成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn).然而絕大多數(shù)厭氧氨氧化菌屬是嚴(yán)格自養(yǎng)生長(zhǎng)菌,其生長(zhǎng)速度很緩慢,同時(shí)對(duì)氧分子等外界環(huán)境因子比較敏感,富集培養(yǎng)比較困難.

為有效保護(hù)厭氧氨氧化菌不受有害環(huán)境因子的影響,可以借助其他脫氮菌群(如好氧氨氧化菌,反硝化菌等)實(shí)現(xiàn)多個(gè)微生物種群之間互利共生.目前實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)最常見(jiàn)的手段是形成生物膜或培養(yǎng)顆粒污泥[3-4].已有研究[5-10]證實(shí)好氧氨氧化菌、反硝化菌和厭氧氨氧化菌可以共存,厭氧氨氧化菌存在于顆粒污泥或生物膜的內(nèi)層,而其他菌群則分布在外層.本試驗(yàn)采用序批式生物膜反應(yīng)器(SBBR),通過(guò)引入填料形成多菌群共存的生態(tài)系統(tǒng).加入的填料易掛膜,系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生的大量的氮?dú)馔瑫r(shí)對(duì)填料進(jìn)行反沖洗,不容易堵塞,成功的啟動(dòng)了SBBR反應(yīng)器.

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)裝置和運(yùn)行條件

試驗(yàn)裝置采用序批式生物膜反應(yīng)器(圖1),反應(yīng)器主體由有機(jī)玻璃制成,有效容積 1L,內(nèi)置改性微生物膜載體(大連宇都環(huán)境工程技術(shù)有限公司),其主要成分為高密度聚乙烯和生物酶的增強(qiáng)成分.填料用的纖維網(wǎng)裝好,便于拆卸.填料單元料粒為環(huán)形,環(huán)形的外徑為 10mm,比重為0.965～0.968,比表面積為 3m2/g,載膜后比重為0.98,填充比為33%左右.由時(shí)間繼電器配合2臺(tái)蠕動(dòng)泵控制進(jìn)水和出水.SBBR運(yùn)行策略為:進(jìn)水10min,反應(yīng)680min,靜沉20min,排水10min.水浴加熱保持SBBR內(nèi)溫度35℃左右,控制進(jìn)水pH值在 7.8左右.為了防止光合細(xì)菌和藻類的生長(zhǎng)影響氨氮去除,反應(yīng)器外部用遮光布包裹.

圖1 反應(yīng)器裝置示意Fig.1 Schematic diagram of the SBBR used in this study.

1.2 接種污泥和人工廢水

SBBR采用本試驗(yàn)室升流式厭氧固定床(UAFB)反應(yīng)器內(nèi)的掛膜填料(附著厭氧生物膜污泥)作為接種污泥[11].在接種前,UAFB反應(yīng)器已在室溫下靜置14個(gè)月.啟動(dòng)初期人工廢水的主要成分如下:NH4Cl為133.7～374.5mg/L, NaNO2為 35～483mg/L,KHCO3為 500mg/L,KH2PO4為10mg/L ,MgSO4·7H2O為60mg/L,CaCl2·2H2O為5mg/L, FeSO4為6.25mg/L,EDTA為6.25 mg/L,微量元素為 1.25mL/L.微量元素的成分如下: ZnSO4·7H2O為 430mg/L,CuSO4·5H2O為 250 mg/L,MnCl2·4H2O 為 990mg/L,NiCl2·6H2O 為190mg/L,CoCl2·6H2O 為 240mg/L,H3BO4為414mg/L,NaSeO4·10H2O為210mg/L, NaSeO4·10H2O為220mg/L[12-14].

1.3 試驗(yàn)項(xiàng)目和測(cè)定方法

氨氮采用納氏試劑分光光度法測(cè)定;亞硝酸鹽氮采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法進(jìn)行的測(cè)定;硝酸鹽氮采用硝酸根電極法進(jìn)行測(cè)定;pH值和DO用德國(guó)WTW(pH/Oxi 340i)手提式多參數(shù)測(cè)試儀進(jìn)行測(cè)定;總氮采用具備 TN測(cè)定附件的TOC-VCPN-6000進(jìn)行測(cè)定.

1.4 微生物群落分析的方法

定期取微生物樣品存放于-25℃冰箱中保存,利用上海生工公司提供的小劑量細(xì)菌提取試劑盒進(jìn)行DNA提取,選取的引物為針對(duì)16SrRNA基因的引物 8F與 1492R,PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒法(上海生工)純化后,進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化.篩選后的克隆文庫(kù)送測(cè)序公司(上海生工)進(jìn)行測(cè)序.在每個(gè)T-RFLP圖譜中,計(jì)算每個(gè)峰(T-RF)的峰面積與所有峰總面積的比率來(lái)表征每個(gè) T-RF的含量.由于存在一定誤差,對(duì)于小于50 bp的片段舍去不進(jìn)行分析,舍去相對(duì)數(shù)量小于 1% 的 T-RF.建立克隆文庫(kù),并對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序與 T-RFLP分析,識(shí)別T-RFLP中不同峰(T-RF)對(duì)應(yīng)的微生物種類.

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 SBBR的脫氮效果

SBBR反應(yīng)器從啟動(dòng)開(kāi)始共運(yùn)行 107d,圖 2反映了該期間反應(yīng)器的脫氮情況可以看到, SBBR的啟動(dòng)期主要分為3個(gè)階段:

第 I階段:脫氮不穩(wěn)定期.該階段從啟動(dòng)日開(kāi)始持續(xù)約 27d.在不穩(wěn)定期,氨氮和亞硝酸鹽氮的含量按照理論值 1:1.32加入,氨氮起始濃度為70mg/L,亞硝酸鹽氮濃度為93mg/L.試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在此期間氨氮和亞硝酸鹽氮的去除不穩(wěn)定,亞硝酸鹽氮的去除率幾乎達(dá)到100%,但是出水氨氮濃度不降反升.在此階段出水幾乎檢測(cè)不到硝酸鹽氮.

第II階段:脫氮過(guò)渡期.第28～55d,由于不穩(wěn)定期底物的去除效果不佳,氨氮和亞硝酸鹽氮進(jìn)水濃度同時(shí)降低到 49mg/L.氨氮開(kāi)始少量去除,亞硝酸鹽氮的平均去除率和初期相比降低50%左右.此時(shí)總氮濃度在 98mg-N/L,其平均去除率僅為20%左右.從第56～90d,氨氮和亞硝酸鹽氮濃度進(jìn)一步降低到 35mg/L,二者去除效果仍然不明顯.平均去除率均在 10%左右,其中出水氨氮在30mg/L以上,亞硝酸鹽氮的出水濃度略低于氨氮濃度.總氮去除率約為 20%.反應(yīng)器在運(yùn)行80d以后在此階段出水硝酸鹽氮的濃度同樣幾乎為零.

第III階段:高效脫氮期.從第90d開(kāi)始,氨氮和亞硝酸鹽氮的進(jìn)水濃度仍然為35mg/L,反應(yīng)器的出水氨氮和亞硝酸鹽氮含量快速下降,出水氨氮低于10mg/L,最低達(dá)到7.1mg/L,出水亞硝酸鹽氮含量為零.和前一階段相比,總氮去除率大幅提高,氨氮的去除率達(dá)到 87.3%,亞硝酸鹽氮幾乎全部去除,而產(chǎn)生的硝酸鹽氮含量較前兩個(gè)階段有明顯提高.從95d開(kāi)始逐漸提高底物濃度,此時(shí)反應(yīng)器最高總氮負(fù)荷為0.67kg-N/m3·d略高于文獻(xiàn)報(bào)道的氮的負(fù)荷[2,15-17].

圖2 反應(yīng)器氮和HRT變化Fig.2 The variation of nitrogen concentration and HRT in SBBR

2.2 厭氧氨氧化現(xiàn)象

圖3 去除亞硝酸鹽氮和降解的氨氮及產(chǎn)生的硝酸鹽氮和降解氨氮的比值Fig.3 Stoichiometric ratio of utilized nitrite/utilized ammonia and generated nitrate/utilized ammonia

根據(jù)其化學(xué)反應(yīng)方程(1),亞硝酸鹽氮與氨氮的去除比為 1.32:1,產(chǎn)生的硝酸鹽氮和去除的氨氮之間的比值為 0.26:1.通過(guò)測(cè)定反應(yīng)器去除氨氮、亞硝酸鹽氮和產(chǎn)生的硝酸鹽氮之間的關(guān)系可以初步判定反應(yīng)器是否出現(xiàn)厭氧氨氧化現(xiàn)象. 研究發(fā)現(xiàn)SBBR前期氨氮和亞硝酸鹽氮的去除沒(méi)有明顯的規(guī)律,反應(yīng)器運(yùn)行60d后,氨氮和亞硝酸鹽氮已接近理論值 1:1.32,產(chǎn)生的硝酸鹽氮和氨氮的比值接近零.但是從第90d以后,降解的亞硝酸鹽氮和氨氮的比值仍然接近理論值1.32,產(chǎn)生的硝酸鹽氮和去除的氨氮之間比值接近0.26(圖3).

2.3 生物膜的變化

反應(yīng)器運(yùn)行期間,定期從反應(yīng)器中取不同時(shí)間的填料進(jìn)行比較觀察(圖4).從填料的掛膜情況來(lái)看,第20d填料內(nèi)部開(kāi)始有少量微生物沉積;第51d,內(nèi)部和外部有成層的生物膜;在運(yùn)行到第81d后,生物膜較厚,生物膜呈現(xiàn)黃褐色.將生物膜刮下置于40倍光學(xué)顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)污泥顏色有明顯的變化.第51d及其之前污泥大多呈棕黑色,但是在第81d以后,污泥顏色逐漸變淺(圖5).T-RFLP圖譜(圖6)表明,污泥接種20d時(shí)T-RF峰多而雜,物種多樣性最大.T-RF為72bp、100bp和420bp的三類峰相對(duì)明顯.51d時(shí),主要T-RF為111bp、421bp、438bp、452bp和 469 bp.81d時(shí),主要的 T-RF為67bp、437bp、452bp和468bp.

圖4 填料的變化情況:第20d、51d和81d的生物膜情況Fig.4 Figures of the carriers used in this study and the biofilms that grew on the surface carriers on day 20, 51 and 81

圖5 反應(yīng)器第51d和81d時(shí)污泥的顯微照片F(xiàn)ig.5 Micrographs of the SBBR sludge on day 51 and 81

圖6 生物膜T-RFLP測(cè)定結(jié)果Fig.6 Microbial communities of the biofilms sampled on day 20、51 and 81 based on the T-RFLP results

3 討論

3.1 SBBR的啟動(dòng)過(guò)程

在脫氮不穩(wěn)定期氨氮出水濃度高于進(jìn)水濃度.亞硝酸鹽氮去除率較高,出水幾乎不含硝酸鹽氮.主要原因是反應(yīng)器接種初期某些微生物死亡,造成細(xì)胞分解產(chǎn)生有機(jī)氮,進(jìn)而轉(zhuǎn)變成氨氮,同時(shí)系統(tǒng)中的反硝化菌利用有機(jī)碳源進(jìn)行反硝化[19],導(dǎo)致亞硝酸鹽氮的去除率較高,出水中幾乎不含硝酸鹽氮.反硝化利用的有機(jī)碳源可能來(lái)源于某些微生物死亡釋放的有機(jī)碳,也有可能是接種污泥中帶入的有機(jī)碳(接種時(shí)是掛膜的填料,為避免種泥從填料上沖洗下來(lái),沒(méi)有進(jìn)行清洗).在前兩階段的運(yùn)行過(guò)程中有機(jī)碳的含量在20mg/L左右,進(jìn)出水濃度變化不大.

進(jìn)入過(guò)渡期,氨氮和亞硝酸鹽氮有少量成比例去除,說(shuō)明底物主要是被厭氧氨氧化菌利用,但是厭氧氨氧化菌的數(shù)量較少,活性較低,利用的底物較少,產(chǎn)生的硝酸鹽的量也較少.不適應(yīng) SBBR環(huán)境的微生物種群逐漸被淘汰出系統(tǒng),但是由于所剩少量的反硝化菌活性較強(qiáng),出水硝酸鹽氮濃度仍較低.此時(shí)厭氧氨氧化菌可能成為系統(tǒng)內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌種,底物利用率較低.

進(jìn)入高效脫氮期后,氨氮和亞硝酸鹽氮的出水濃度明顯下降且開(kāi)始成比例去除,硝酸鹽氮的濃度和前2個(gè)時(shí)期相比有一定提高.同時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)器內(nèi)TOC含量有明顯的變化,由前兩階段的大于20mg/L降低到10mg/L以下,反硝化的作用由于缺少有機(jī)碳源而減弱.厭氧氨氧化作用逐漸增強(qiáng),此時(shí)厭氧氨氧化菌達(dá)到了一定的數(shù)量,底物的利用率有明顯的上升,厭氧氨氧化菌開(kāi)始成為系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)菌(圖7)[20].

3.2 SBBR的優(yōu)勢(shì)

厭氧氨氧化菌的世代時(shí)間長(zhǎng),對(duì)環(huán)境(如氧分子)敏感.袁怡等[21]發(fā)現(xiàn)進(jìn)水不除溶解氧的反應(yīng)器會(huì)使厭氧氨氧化現(xiàn)象滯后.另外,厭氧氨氧化菌培養(yǎng)過(guò)程中污泥的流失是造成厭氧氨氧化菌富集培養(yǎng)失敗的重要原因.

本試驗(yàn)研究表明 SBBR反應(yīng)器具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì):

SBBR填料為厭氧氨氧化菌提供了良好的生長(zhǎng)微環(huán)境.盡管厭氧氨氧化菌嚴(yán)格厭氧,但是由于外層生物膜(主要是好氧菌或兼性菌)的保護(hù)作用[22],在生物膜內(nèi)層的厭氧氨氧化菌并未因反應(yīng)器無(wú)蓋而受到影響.經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的運(yùn)行,厭氧氨氧化現(xiàn)象逐漸明顯,亞硝酸鹽氮和氨氮的比值開(kāi)始接近理論值1.32(圖3),這與以往的研究結(jié)果非常接近[23].從污泥形態(tài)上來(lái)看,污泥逐漸從黑棕色變成黃褐色(圖5),也表明厭氧氨氧化菌的濃度逐漸增大[24].

SBBR填料承載污泥效果明顯.由于磁力攪拌作用不強(qiáng),污泥幾乎全部附著在填料層,為形成生物膜提供了良好的基礎(chǔ).試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)反應(yīng)器底部水質(zhì)澄清,減少了出水時(shí)污泥沉淀時(shí)間.

SBBR具備較強(qiáng)的抗沖擊負(fù)荷能力和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力.厭氧氨氧化菌生長(zhǎng)的適宜溫度在35℃左右,但是本試驗(yàn)采用常溫進(jìn)水,冬季哈爾濱自來(lái)水溫度甚至低至 4～5℃.盡管如此,進(jìn)入高效脫氮期后并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)脫氮速率波動(dòng)的情況.另外,進(jìn)水溶解氧始終大于 1.0mg/L,反應(yīng)器與空氣接觸(敞口運(yùn)行),進(jìn)入反應(yīng)器20min后,溶解氧的濃度低于 0.5mg/L.因此,低溫進(jìn)水和較高溶解氧對(duì)反應(yīng)器的影響不大.

SBBR啟動(dòng)速度快,效率高,不易堵塞,反應(yīng)器啟動(dòng)時(shí)間相對(duì)較短.SBBR反應(yīng)器僅用3個(gè)月即實(shí)現(xiàn)厭氧氨氧化過(guò)程,與同類研究[2,25-26]相比,啟動(dòng)時(shí)間大大縮短.IKUO[27]研究證實(shí)縮短HRT和加大氨氮和亞硝酸鹽氮的摩爾比有利于提高總氮負(fù)荷,但是氨氮和亞硝酸鹽氮的轉(zhuǎn)化率較低,而SBBR系統(tǒng)通過(guò)縮短HRT,提高氮的負(fù)荷.HRT從72h縮短至 12h后,氨氮和亞硝酸鹽氮的轉(zhuǎn)化率沒(méi)有受到影響.同時(shí),從反應(yīng)器外壁可以觀察到大量得氣泡,由于底部攪拌的作用,從反應(yīng)器底部向上溢出,可能對(duì)填料有一定的清洗作用,避免堵塞,造成短流.

3.3 微生物群落結(jié)構(gòu)

T-RFLP圖譜上每一個(gè)末端限制性酶切片段(T-RF)至少代表一種微生物(如圖7).每個(gè)峰面積和總峰面積的比值(Pi)反映出該物種的相對(duì)數(shù)量.反應(yīng)器運(yùn)行前20d的微生物種類較多,物種相對(duì)含量相差不大.51d時(shí),微生物種類逐漸減少.81d時(shí),菌種變得比較單一.從20d到81d,1號(hào)菌種因不適應(yīng)反應(yīng)器環(huán)境而逐漸被淘汰(相對(duì)數(shù)量由 8.28%減少到 2.47%).3號(hào)菌種是淡水環(huán)境中較常見(jiàn)的厭氧氨氧化菌 Anammoxoglobus propionicus[28],其相對(duì)含量由11.61%(51d)增加到40.06%(81d).反應(yīng)器運(yùn)行到后期, Anammoxoglobus propionicus成為系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)菌種.2號(hào)菌種從小于1%增加到9.13%,4號(hào)菌種的數(shù)量從2.99%增加到 14.08%,關(guān)于其功能和屬性還有待進(jìn)一步研究.微生物相對(duì)含量的變化體現(xiàn)了微生物群落演替的過(guò)程.這個(gè)變化過(guò)程影響了系統(tǒng)脫氮能力,同時(shí)為 3個(gè)脫氮時(shí)期的劃分提供了理論依據(jù).

4 結(jié)論

4.1 反應(yīng)器的啟動(dòng)期主要經(jīng)歷3個(gè)階段:脫氮不穩(wěn)定期,脫氮過(guò)渡期和高效脫氮期.脫氮過(guò)渡期開(kāi)始出現(xiàn)厭氧氨氧化現(xiàn)象,達(dá)到高效脫氮期后,反應(yīng)器內(nèi)厭氧氨氧化現(xiàn)象明顯,總氮去除率較高,達(dá)到87.3%.

4.2 SBBR反應(yīng)器因內(nèi)置填料并形成生物膜,具有較強(qiáng)抗沖擊能力,較低進(jìn)水溫度和少量溶解氧對(duì)SBBR系統(tǒng)的影響很小,厭氧氨氧化脫氮系統(tǒng)穩(wěn)定且高效.

4.3 系統(tǒng)中微生物群落出現(xiàn)較為明顯的動(dòng)態(tài)演替現(xiàn)象.厭氧氨氧化菌 Anammoxoglobus propionicus在后期逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌種.

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