人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因引物設(shè)計(jì)方法的改良

姜晶，孫穎，劉紅艷，牟玲，羅恩杰*

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng)110001，2.沈陽(yáng)市傳染病院腎綜合征出血熱研究所，遼寧沈陽(yáng)110006)

基因工程抗體具有分子量小、組織穿透力強(qiáng)、體內(nèi)清除快、免疫原性低、易于原核表達(dá)大量生產(chǎn)和進(jìn)行基因工程改進(jìn)等優(yōu)點(diǎn)［1］?；蚬こ炭贵w的構(gòu)建關(guān)鍵是抗體可變區(qū)(V)基因的獲得［2］。自O(shè)rlandi等［3］最早進(jìn)行抗體V基因擴(kuò)增以來(lái)，20多年來(lái)V基因擴(kuò)增仍然是一個(gè)熱點(diǎn)課題，倍受科研工作者的重視。這是由于從雜交瘤細(xì)胞或外周血單核細(xì)胞中擴(kuò)增抗體可變區(qū)，是構(gòu)建ScFv［4］、克隆單克隆抗體和研究抗原與抗體相互作用的關(guān)鍵步驟。而抗體可變區(qū)的高度變異性使擴(kuò)增相對(duì)困難，至今仍是一個(gè)難點(diǎn)。其中，PCR引物的設(shè)計(jì)對(duì)于能否順利擴(kuò)增抗體基因起關(guān)鍵作用。在引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)盡可能保持親本抗體可變區(qū)序列的完整性和真實(shí)性，盡管抗體分子可變區(qū)有著數(shù)量巨大的多樣性，但其骨架區(qū)、前導(dǎo)區(qū)和恒定區(qū)相對(duì)保守。目前，包含抗體胚系(germ line)基因序列的數(shù)據(jù)庫(kù)主要有Vbase2、IMGT和IgBLAST數(shù)據(jù)庫(kù)。隨著人類抗體胚系基因序列的測(cè)序完成，人們對(duì)抗體結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)更深入了一步，使得對(duì)人抗體基因的操作更加簡(jiǎn)單易行，使PCR擴(kuò)增人全部可變區(qū)基因成為可能。本研究通過(guò)一個(gè)開(kāi)放的簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)平臺(tái)iCODEHOP［5］，針對(duì)可變區(qū)基因框架區(qū)FR1和FR4自主設(shè)計(jì)一套新的重鏈可變區(qū)引物，為獲得新型基因工程抗體及構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)、生物信息學(xué)軟件人免疫球蛋白對(duì)應(yīng)的V、J胚系基因序列來(lái)自國(guó)際免疫遺傳學(xué)信息數(shù)據(jù)庫(kù)(IMGT)(http://www.imgt.org/)和IgBLAST數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ig blast)。開(kāi)放的簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)平臺(tái)iCODEHOP(https://icodehop.cphi.washington.edu/i-codehop-context/Welcome)。

1.1.2 質(zhì)粒、菌株、工具酶及試劑PMD18-T載體購(gòu)自TAKARA公司，大腸埃希菌E.coli TG1由本實(shí)驗(yàn)室保存;DNA Marker DL2000、RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒(RNA PCR Kit(AMV)Version 3.0)等均購(gòu)自TAKARA公司;小量質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、Taq酶購(gòu)自天根生化科技有限公司;淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自鼎國(guó)生物制品有限公司;PAGE級(jí)引物由大連寶生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析首先，從IMGT和Ig-BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)獲得了全部胚系基因序列，其中包含功能性基因及假基因。由于假基因序列的不完整性和復(fù)雜性，在引物設(shè)計(jì)時(shí)必須去除假基因，只覆蓋所有的功能性基因。根據(jù)編碼VH基因FR1的胚系基因V片段基因家族的不同分成7組。然后通過(guò)BlockMaker服務(wù)器將同一家族內(nèi)的序列進(jìn)行比對(duì)，找出高度保守區(qū)域。編碼VH基因FR4的胚系基因J片段共有13個(gè)核苷酸序列放在一組中自行找出保守區(qū)。

1.2.2 CODEHOP引物設(shè)計(jì)CODEHOP引物是由簡(jiǎn)并的核心區(qū)和非簡(jiǎn)并的夾板區(qū)組成。核心區(qū)位于引物的3'端，是通過(guò)多序列比對(duì)獲得的高度保守區(qū)的3～4個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)的所有可能的密碼子集合。夾板區(qū)位于引物的5'端，是由緊鄰高度保守區(qū)的氨基酸序列決定的，主要根據(jù)人胚系基因的序列比對(duì)后的常用密碼子設(shè)計(jì)，這個(gè)區(qū)域的長(zhǎng)度通常是15～20個(gè)堿基，可以根據(jù)用戶需要自行調(diào)整。在通過(guò)BlockMaker服務(wù)器獲得的高度保守區(qū)域中使用iCODEHOP系統(tǒng)軟件的默認(rèn)參數(shù)設(shè)計(jì)可變區(qū)引物。反向引物是通過(guò)13個(gè)J片段核苷酸序列手動(dòng)設(shè)計(jì)。

1.2.3 VH基因的擴(kuò)增①cDNA合成:取未經(jīng)免疫的健康人外周血5 mL，用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞。參照RNA提取試劑盒使用說(shuō)明，提取總RNA。按照TAKARA RNA PCR Kit(AMV)Version 3.0說(shuō)明進(jìn)行第一鏈反轉(zhuǎn)錄合成得到cDNA;②PCR擴(kuò)增VH基因:以cDNA為模板應(yīng)用自主設(shè)計(jì)的CODEHOP引物擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)基因。反應(yīng)體系50 μL;反應(yīng)條件:94℃5 min;94℃30 s、55℃30 s、72℃1 min;共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物于1%凝膠中電泳，電壓80 V，30 min后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描;③VH基因的鑒定:PCR產(chǎn)物純化后連入PMD18-T載體中，對(duì)多個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物設(shè)計(jì)

通過(guò)iCODEHOP設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物共獲得5'端引物7條。根據(jù)13條胚系基因J區(qū)的核苷酸序列手動(dòng)設(shè)計(jì)獲得3'引物1條，分別與7條5'端引物配對(duì)使用(表1)。這套引物可以擴(kuò)增人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)框架區(qū)1(FR1)至框架區(qū)4(FR4)(圖1)。

2.2 VH基因的擴(kuò)增

應(yīng)用自主設(shè)計(jì)的引物，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得VH基因。如圖所示，每對(duì)引物擴(kuò)增的基因大小都與預(yù)期一致，大小約為350 bp(圖2)。

表1 擴(kuò)增人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因的引物Table 1 Primers for PCR amplification of Ig VH genes

2.3 VH基因多樣性分析

為了鑒定PCR產(chǎn)物的特異性和多樣性，將PCR產(chǎn)物純化，克隆入PMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化TG1菌，多個(gè)單克隆提取后測(cè)序，與GenBank和IMGT/V-QUEST數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)表明，序列分析均為人Ig重鏈可變區(qū)基因，包含4個(gè)FR區(qū)和3個(gè)CDR區(qū)，V、D、J 3個(gè)基因經(jīng)重排后相互連接在一起，形成V-D-J復(fù)合體，完成重鏈重排。對(duì)編碼VH基因序列的胚系基因來(lái)源進(jìn)行了分析，顯示了其多樣性(表2)。

表2 重鏈可變區(qū)基因的多樣性分析Table 2 Ig VH gene diversity analysis

3 討論

隨著人類抗體胚系基因序列的測(cè)序完成，編碼重鏈可變區(qū)基因的V、D、J基因片段可從IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得，使PCR擴(kuò)增人全部可變區(qū)基因成為了可能。為了有效地?cái)U(kuò)增人Ig可變區(qū)基因，首先設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)考慮的原則就是不影響產(chǎn)物多樣性的前提下減少引物的數(shù)量。本研究通過(guò)選擇不同胚系基因家族內(nèi)的高度保守區(qū)來(lái)達(dá)到這一目的。

為了獲取抗體基因，通常有3種設(shè)計(jì)思路:①在框架區(qū)FRl和FR4設(shè)計(jì)引物，可直接獲得V基因;②設(shè)計(jì)套式PCR引物，先在信號(hào)肽和C區(qū)設(shè)計(jì)引物，再在FR1和FR4區(qū)設(shè)計(jì)引物，可提高引物的特異性并獲得完全真實(shí)的V區(qū)序列，但信號(hào)肽序列變化較大，不易設(shè)計(jì);③5'-RACE或3'-RACE，設(shè)計(jì)的引物可針對(duì)C區(qū)或polyA區(qū)，用此方法也可獲得完全真實(shí)的V區(qū)序列，而且不易漏過(guò)可用的抗體基因，可用于通用引物無(wú)法擴(kuò)增的雜交瘤細(xì)胞，但操作比較繁瑣［6］。本研究在框架區(qū)FRl和FR4設(shè)計(jì)引物，直接獲得了Ig重鏈可變區(qū)基因，設(shè)計(jì)方法簡(jiǎn)便有效。

目前有許多公共的開(kāi)放工具都是根據(jù)核苷酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，然而對(duì)于數(shù)量較大的基因片段，從氨基酸序列中尋找高度保守區(qū)可行性更高。GeneFisher［7］和iCODEHOP都是以氨基酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物，用GeneFisher所設(shè)計(jì)的引物在任何位點(diǎn)都可以有簡(jiǎn)并堿基，在PCR過(guò)程每一循環(huán)中都不能與模板完全匹配。而用iCODEHOP所設(shè)計(jì)的引物包括兩部分，一部分是長(zhǎng)度為11～12個(gè)堿基的3'簡(jiǎn)并核心區(qū)，一部分是根據(jù)保守氨基酸和密碼子偏好性原則設(shè)計(jì)的5'非簡(jiǎn)并夾板區(qū)。用iCODEHOP引物擴(kuò)增時(shí)，在第1個(gè)循環(huán)只有1種組合的特異性引物的3'核心區(qū)與目的基因完全匹配，但從第2個(gè)循環(huán)開(kāi)始，每一個(gè)引物的5'夾板區(qū)都與第1輪擴(kuò)增的模版完全匹配，所以就增加了擴(kuò)增的特異性、準(zhǔn)確性和成功率。

iCODEHOP過(guò)去常被用于對(duì)未知基因的引物設(shè)計(jì)，如:不同物種的同源基因、相同基因組的種內(nèi)同源基因或者不同宿主中的新病原體［8-9］。本研究首次將iCODEHOP用于Ig可變區(qū)基因的引物設(shè)計(jì)。為了驗(yàn)證引物的特異性，對(duì)一些重組的單克隆進(jìn)行了測(cè)序分析。盡管測(cè)序的數(shù)量不大、每一對(duì)引物也不是特異性擴(kuò)增所屬家族內(nèi)的序列，但序列分析仍然顯示了基因的多樣性。也即表明了iCODEHOP所設(shè)計(jì)引物的有效性，為擴(kuò)增其他物種可變區(qū)基因或T細(xì)胞受體(TCR)提供了新的設(shè)計(jì)思路。

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