海洋耐高溫酸性α-淀粉酶水解玉米淀粉的研究

李瑛，呂明生，王淑軍，李華鐘，房耀維，焦豫良，劉姝

(1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122;2.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇連云港222005)

高溫α-淀粉酶是淀粉液化中主要采用的酶［1］，該酶的應(yīng)用對(duì)整個(gè)液化工藝起關(guān)鍵性作用。目前工業(yè)用高溫α-淀粉酶主要來(lái)自嗜熱脂肪芽胞桿菌(Geobacillus stearothermophilus)和地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)，這些酶存在耐熱性差、最適pH高(6.0)、酶熱穩(wěn)定性需Ca2+維持［2］等缺點(diǎn)。因此工業(yè)水解淀粉制糖時(shí)需先將粉漿由天然酸性pH 4.5左右調(diào)至6.0進(jìn)行液化，在下一步糖化時(shí)還需根據(jù)糖化酶的性質(zhì)將pH調(diào)回4.0～4.5。反復(fù)調(diào)節(jié)pH增加了生產(chǎn)成本和產(chǎn)生副產(chǎn)物的可能［3］。隨著企業(yè)技術(shù)水平的提高和節(jié)約用水的管理，部分淀粉調(diào)漿水采用產(chǎn)品蒸發(fā)濃縮產(chǎn)生的二次冷凝水。這種冷凝水較為純凈，幾乎不含有Ca2+、Na+等離子［4］，目前用于工業(yè)生產(chǎn)的淀粉酶由于其熱穩(wěn)定性依賴于Ca2+，對(duì)于保持酶解效果的持續(xù)穩(wěn)定和淀粉液化工藝的穩(wěn)定還有所欠缺。海洋是微生物的寶庫(kù)，從海洋中篩選獲得符合工業(yè)生產(chǎn)的酶也已成為近幾年的熱點(diǎn)?？梢栽?0～110℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)的深海嗜熱古菌，是高溫α-淀粉酶最重要的來(lái)源。許多研究者致力于高溫α-淀粉酶的研究，以期獲得新型高溫α-淀粉酶以解決目前高溫α-淀粉酶存在的問(wèn)題，以研究較為深入的Pyrococcus furiosus的高溫酸性淀粉酶基因［5］為例，1997年丹麥Steen［6］將Pyrococcus furiosus的α-淀粉酶基因分別在大腸埃希菌和枯草桿菌中成功表達(dá)，2003年國(guó)內(nèi)的沈微等［7］實(shí)現(xiàn)了該基因在大腸埃希菌中的分泌表達(dá)，2006年郭建強(qiáng)等［3］實(shí)現(xiàn)了在畢赤酵母中的高效分泌表達(dá)。本研究小組從深海熱液口獲得了1株產(chǎn)耐高溫酸性α-淀粉酶的超嗜熱古菌Thermococcus siculi HJ21，并對(duì)該高溫耐酸性α-淀粉酶的基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)、重組酶純化、酶學(xué)性質(zhì)、定向進(jìn)化等研究［8-10］。該酶的最適作用溫度為95℃，在100℃仍有60%的酶活力，酶的熱穩(wěn)定性不依賴于Ca2+，且熱穩(wěn)定性好，酶在90℃的半衰期為5 h，100℃處理2 h后仍有40%的酶活。酶的最適作用pH為5.0，在pH 4.5仍有80%的活力，pH在5.5～7.0較穩(wěn)定。可以解決目前應(yīng)用耐高溫α-淀粉酶存在的3方面問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)對(duì)該工程菌所產(chǎn)的海洋耐高溫酸性α-淀粉酶的水解工藝進(jìn)行研究，為新型高溫淀粉酶的工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株重組耐高溫酸性α-淀粉酶基因工程菌E.coli BL21/pET28a-amy，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，pH 7.5。使用時(shí)加入終濃度為50 μg/mL的卡那霉素。

1.1.3 材料與試劑玉米淀粉，無(wú)錫永豐淀粉工程有限公司;胰蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、可溶性淀粉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、葡萄糖等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.4 儀器與設(shè)備回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜，上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司;DK-S22型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;PHS-2C型精密酸度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器廠;DHG-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司;計(jì)時(shí)器及各種玻璃器皿。

1.2 方法

1.2.1 高溫酸性α-淀粉酶的制備將工程菌E.coli BL21/pET28a-amy接種于含有50 μg/mL卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)過(guò)夜制備種子液;再將種子液轉(zhuǎn)接至上述培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6左右，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG同條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h;4℃，10 000 r/min離心5 min收集菌體;將誘導(dǎo)表達(dá)收集的菌體用磷酸緩沖液(0.5 mmol/L、pH 7.0)重懸菌體，超聲波破碎菌體(400 W，超聲3 s，停7 s，共超聲15 min)，4℃，12 000 r/min離心10 min，收集上清液作為粗酶液。

1.2.2 酶解工藝流程精確稱取一定質(zhì)量的玉米淀粉，加水調(diào)成所需濃度的粉漿，加酸或堿調(diào)節(jié)至所需pH，移入恒溫水浴鍋中按要求加入一定量的耐高溫α-淀粉酶，反應(yīng)一段時(shí)間后取出滅酶并冷卻液化液，測(cè)定DE值［11］。由于水分含量小于30%時(shí)，淀粉糊化較為緩慢且不完全，同時(shí)兼顧設(shè)備利用率等方面，文中采用300 g/L的粉漿濃度為起始濃度［12］。

1.2.3 DE值測(cè)定方法直接滴定法測(cè)定還原糖含量［13］，水解液中還原糖以葡萄糖計(jì)占干物質(zhì)的百分比為DE值。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)方法及最佳水解工藝的確定

以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的基因工程菌所產(chǎn)的耐高溫酸性α-淀粉酶為液化酶，以液化溫度90℃，玉米淀粉天然pH，酶用量為16 U/g淀粉、粉漿濃度為300 g/L為基本實(shí)驗(yàn)條件，分別改變液化時(shí)間、酶用量、液化溫度、粉漿濃度及液化pH等條件來(lái)考察其對(duì)玉米淀粉液化效果的影響。為了確定酶水解玉米淀粉的最佳工藝條件，根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9(34)，試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 耐高溫酸性α-淀粉酶正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factor and level of orthogonal test of the thermo-stable and acid-stable α-amylase

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米淀粉液化影響因素研究

2.1.1 液化時(shí)間對(duì)液化的影響從圖1中可以看出，淀粉液化在75 min以內(nèi)時(shí)速度很快，DE值增加迅速，在75 min以后，DE值的增加量趨緩。分析原因可能是α-淀粉酶對(duì)長(zhǎng)鏈淀粉或糊精水解的速度比短鏈快，隨著水解的進(jìn)行，液化液中短鏈多糖數(shù)量逐漸增加，從而使水解的速度變慢［14］。同時(shí)玉米淀粉中含有直鏈淀粉和支鏈淀粉，兩者的比例和含量對(duì)淀粉的水解有一定影響［15］，α-1，6糖苷鍵的存在又進(jìn)一步影響了酶的水解速度。因此，該酶的液化時(shí)間控制在75 min左右為宜。后續(xù)的單因素試驗(yàn)水解時(shí)間均控制為75 min。

圖1 液化時(shí)間對(duì)DE值的影響Fig.1 Effect of different time on DE value

2.1.2 酶用量對(duì)液化的影響從圖2中可見(jiàn)，液化DE值隨著酶用量的增加而增加，在酶用量8～16 U/g淀粉范圍內(nèi)增幅明顯，酶用量超過(guò)16 U/g淀粉時(shí)，DE值增長(zhǎng)漸緩。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是隨著酶用量的增加，底物相對(duì)變少，使得酶用量對(duì)水解速率的影響減弱。因此酶的用量為16 U/g淀粉以上時(shí)開(kāi)始趨于飽和，酶的催化效果也發(fā)揮到最大，選擇該范圍的酶用量可以平衡工業(yè)生產(chǎn)成本與產(chǎn)品質(zhì)量(淀粉水解的程度)的關(guān)系，獲得較理想的結(jié)果。

2.1.3 溫度對(duì)液化的影響從圖3中可以看出，液化DE值的最高點(diǎn)出現(xiàn)在90℃處，溫度太低時(shí)淀粉鏈不能充分伸展，且酶分子的作用速率較低，導(dǎo)致酶切只能在局部較為緩慢的進(jìn)行，液化的DE值較低;溫度過(guò)高時(shí)超過(guò)了淀粉酶的最適作用溫度，酶分子出現(xiàn)失活現(xiàn)象，導(dǎo)致液化DE值下降［16］。目前工業(yè)上采用液化的主流工藝為瞬間高溫噴射液化，淀粉顆粒在噴射罐105～110℃經(jīng)過(guò)5 min的高溫噴射糊化變成液狀［17］，因此液化時(shí)采用的液化酶的作用溫度越接近105～110℃越好，本實(shí)驗(yàn)室制備的淀粉酶最適作用溫度為90℃，在105～110℃時(shí)仍有催化活性，基本可以滿足工業(yè)應(yīng)用需求。

圖2 酶用量對(duì)DE值的影響Fig.2 Effect of dosage of amylase on DE value

圖3 溫度對(duì)DE值的影響Fig.3 Effect of different temperature on DE value

2.1.4 不同粉漿濃度對(duì)液化的影響從圖4中看出，隨粉漿濃度的增加，玉米淀粉液化DE值下降，當(dāng)粉漿濃度超過(guò)300 g/L時(shí)，DE值下降明顯，液化DE值隨粉漿濃度增大而下降的原因可能是粉漿濃度增大不利于底物與淀粉酶的結(jié)合。水作為一種增塑劑，可影響淀粉分子的遷移，決定淀粉分子鏈間的聚合速率，對(duì)淀粉的糊化和老化特性影響很大［18］。含水量太低時(shí)淀粉糊化不完全，使得淀粉酶不能很好地發(fā)揮作用。在工業(yè)應(yīng)用上綜合考慮提高設(shè)備利用率、降低用水量、保證液化效率等因素，選擇200～300 g/L的淀粉濃度較為合適。

圖4 粉漿濃度對(duì)DE值的影響Fig.4 Effect of different concentration of starch on DE value

2.1.5 不同pH對(duì)液化的影響從圖5中看出，該酶的最適水解pH是4.5，高于或者低于這個(gè)pH后水解DE值均會(huì)有不同程度的下降。之前對(duì)該淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)研究表明其最適作用pH為5.0，而本實(shí)驗(yàn)中獲得的最適水解pH為4.5，這可能是由于高濃度的淀粉對(duì)酶分子具有保護(hù)作用，使得其作用的pH范圍變寬，最適的水解pH出現(xiàn)了遷移。淀粉制糖工業(yè)中液化之后需再進(jìn)行糖化，所采用的糖化酶一般有較窄的pH適應(yīng)范圍，最適pH一般為4.5～6.5［19］。目前工業(yè)上的糖化操作較為簡(jiǎn)單，將液化液冷卻至55～60℃后，調(diào)節(jié)pH值為4.5左右，加人適量糖化酶進(jìn)行保溫糖化，到所需DE值時(shí)即可升溫滅酶，進(jìn)入后道凈化工序。因此采用該酶液化淀粉時(shí)可以避免淀粉制糖過(guò)程反復(fù)調(diào)節(jié)粉漿pH，簡(jiǎn)化生產(chǎn)過(guò)程、節(jié)約成本，具有較好的應(yīng)用潛力。

圖5 pH對(duì)DE值的影響Fig.5 Effect of different pH on DE value

2.2 玉米淀粉液化優(yōu)化參數(shù)研究

根據(jù)以上研究結(jié)果，分別選擇液化溫度、液化時(shí)間、粉漿濃度、酶用量4個(gè)影響較大的因素，并以各因素的最佳實(shí)驗(yàn)條件為依據(jù)確定其最佳使用范圍，進(jìn)行正交試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析［20］，分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 耐高溫酸性α-淀粉酶酶解試驗(yàn)方案及結(jié)果分析Table 2 Text scheme and result of the thermo-stable and acid-stable α-amylase

從表2中各因素不同水平的均值可直觀地看出，各因素水平對(duì)結(jié)果影響的強(qiáng)弱順序?yàn)锳3＞A1＞A2，B1＞B2＞B3，C1＞C2＞C3，D3＞D2＞D1。從表3中可以看出，因素A(液化時(shí)間)、C(淀粉乳濃度)、D(酶用量)的顯著性P＜0.01，說(shuō)明本次試驗(yàn)所選擇這3個(gè)因素的改變對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響是極顯著的;因素B(液化溫度)的顯著性0.01＜P＜0.05，說(shuō)明液化溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響;影響因素主次順序?yàn)锳＞D＞C＞B，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析得到的最佳水平組合為A3、B1、C1、D3，即液化時(shí)間90 min、液化溫度85℃、粉漿濃度250 g/L、酶用量32 U/g淀粉。

表3 正交設(shè)計(jì)的方差分析Table 3 Variance analysis of the experiments

3 討論

通過(guò)試驗(yàn)得到新型海洋耐高溫酸性α-淀粉酶水解玉米淀粉的最佳水解工藝為液化時(shí)間90 min、液化溫度85℃、粉漿濃度250 g/L、酶用量32 U/g淀粉。該酶與傳統(tǒng)的淀粉酶相比，水解過(guò)程不依賴于Ca2+，具有耐高溫酸性的特點(diǎn)，符合工業(yè)生產(chǎn)，且水解過(guò)程簡(jiǎn)單易于操作，為新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

［1］ 孫曉菲，李?lèi)?ài)江.α-淀粉酶的應(yīng)用及研究現(xiàn)狀［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2008，(6):13-14.

［2］ Van Der Maarel M，Van Der Veen B，Uitdehaag J，et al.Properties and application of starch-converting enzymes of the α-amylase family［J］.Biotechnology，2002，94(2):137-155.

［3］ 郭建強(qiáng)，李運(yùn)敏，岳麗麗，等.超耐熱酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在酵母細(xì)胞中的表達(dá)［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2006，22(2):237.

［4］ 徐正康，羅建勇，郭峰，等.Na+、Ca2+對(duì)淀粉漿中耐高溫淀粉酶酶解效果的影響［J］.現(xiàn)代食品科技，2010，26(7):700-702.

［5］ Suganuma T，fujita K，Kitahara K.Some distinguishable properties between acid Stable and neutraltypes of α-amylases from acid producing koji［J］.Tournal of Bioscience and Bioengineering，2007，104(5):353-362.

［6］ Steen J，Constantin E.V，Garabed A.Cloning，sequencing，characterization，and expression of an extracellular α-amylase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus in Escherichia coli and Bacillus subtilis［J］.The Journal of Biological Chemistry，1997，272(2):16335-16342.

［7］ 沈微，王正祥，唐雪明，等.古細(xì)菌Pyrococcus furiosus高嗜熱α-淀粉酶基因在大腸埃希菌中的分泌表達(dá)［J］.中國(guó)釀造，2003，(1):12-14.

［8］ 姚婷，李華鐘，房耀維，等.定點(diǎn)突變提高Thermococcus siculi HJ21高溫酸性α-淀粉酶催化活性的研究［J］.食品科學(xué)，2011，32(15):148-152.

［9］ 胡建恩，曹茜，楊帆，等.高溫α-淀粉酶高密度高表達(dá)發(fā)酵條件的研究［J］.食品科學(xué)，2012，33(1):219-225.

［10］ 王淑軍，呂明生，秦松，等.熱球菌HJ21高溫-淀粉酶基因克隆、表達(dá)和性質(zhì)研究［J］.海洋學(xué)報(bào)，2011，33(3):158-164.

［11］ 郝曉敏，王遂，崔凌飛.α-淀粉酶水解玉米淀粉的研究［J］.食品科學(xué)，2006，27(2):141-143.

［12］ 徐良增，許時(shí)嬰，楊瑞金.酶法液化玉米淀粉制備麥芽糊精的研究［J］.食品工業(yè)，2001，(3):24-25.

［13］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB5009.7-85.食品中還原糖的測(cè)定方法［S］.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1985.

［14］ 王兆生，董海洲.耐高溫α-淀粉酶在玉米淀粉制備結(jié)晶葡萄糖中的研究［J］.中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2006，(4):27-30.

［15］ 李海普，李彬，歐陽(yáng)明，等.直鏈淀粉和支鏈淀粉的表征［J］.食品科學(xué)，2010，31(11):273-277.

［16］ 王立剛，胡晨俊，李安東.α-淀粉酶降解淀粉性能研究［J］.遼寧化工，2008，37(4):223-226.

［17］ 楊玉嶺.淀粉轉(zhuǎn)化生產(chǎn)葡萄糖的工藝研究［D］.無(wú)錫:江南大學(xué)，2005.

［18］ 周?chē)?guó)燕，胡琦瑋，李紅衛(wèi)，等.水分含量對(duì)淀粉糊化和老化特性影響的差示掃描量熱法研究［J］.食品科學(xué)，2009，30(19):89-92.

［19］ 張秀媛，袁永俊，何擴(kuò).糖化酶的研究概況［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2006，27(9):163-166.

［20］ 夏傳濤，袁秉祥.無(wú)空列正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及SPSS軟件的數(shù)據(jù)處理［J］.數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志，2006，19(1):91-92.