微滲析技術(shù)用于金黃膏在大鼠體內(nèi)經(jīng)皮滲透性的初步研究*

張 倩，尹忠鵬，趙海南，龐曉晨，馬 麗，郭 林，劉志東，王 紅

微滲析技術(shù)用于金黃膏在大鼠體內(nèi)經(jīng)皮滲透性的初步研究*

張 倩，尹忠鵬，趙海南，龐曉晨，馬 麗，郭 林，劉志東，王 紅

[目的]研究金黃膏在大鼠體內(nèi)的經(jīng)皮滲透性。[方法]應(yīng)用經(jīng)皮微滲析在體取樣技術(shù)，以Wistar大鼠為模型動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。微滲析探針的在體回收率采用反向滲析法測(cè)定。[結(jié)果]反向滲析法測(cè)定的在體回收率為（32．81±1．33）%。滲析液中的藥物穩(wěn)態(tài)流量（Js）為2．73 ng/h，滯后時(shí)間（Tlag）為1．50 h。[結(jié)論]金黃膏中的有效成分在皮膚內(nèi)有一定的滯留量，該制劑適合經(jīng)皮給藥。

經(jīng)皮微滲析；鹽酸小檗堿；經(jīng)皮吸收；高效液相色譜法

將微滲析在體取樣技術(shù)應(yīng)用于藥物的經(jīng)皮吸收研究中，稱(chēng)之為經(jīng)皮微滲析（cutaneous microdialysis）[1-4]。此技術(shù)直到 1991年 Anderson等[5]對(duì)微滲析探針進(jìn)行改進(jìn)，并研究了人體對(duì)乙醇的經(jīng)皮吸收，才開(kāi)始了真正意義上的經(jīng)皮微滲析，此后這項(xiàng)技術(shù)發(fā)展非常迅速，為該領(lǐng)域的研究提供了一種新方法。對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚組織進(jìn)行在體、連續(xù)的藥物濃度監(jiān)測(cè)，是經(jīng)皮微滲析技術(shù)的重要特點(diǎn)，為在體研究外用制劑的經(jīng)皮吸收動(dòng)力學(xué)和生物等效性提供了有效的方法，微滲析技術(shù)在透皮給藥方面已得到廣泛應(yīng)用。

金黃膏是一種良好的治療瘡毒紅腫疼痛等疾病的中藥復(fù)方膏劑，外敷能達(dá)到清熱除濕、解毒消腫、散瘀止痛的效果[6]。其主要由姜黃、白芷、大黃、黃柏、天南星、厚樸、陳皮等10味中藥組成。由于小檗堿為該膏劑主藥黃柏中含量較高的成分，含量可達(dá)總生物堿的85%以上[7]，故本實(shí)驗(yàn)以小檗堿為檢測(cè)指標(biāo)來(lái)研究藥物在動(dòng)物體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的規(guī)律及特點(diǎn)。

1 材料與儀器

金黃膏（由天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室提供）；鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110713-200609）；乙腈（天津市康科德科技有限公司，色譜純）；磷酸二氫鉀（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，分析純）；磷酸（天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠，分析純）；烏拉坦（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，分析純）。Wistar大鼠,雌雄兼用，體質(zhì)量200~250 g，天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（津）2010-0002。CMA-102型微量泵控制器（CMA公司，瑞典）；LM-10線型微滲析探針（Bioanalytical systems，美國(guó)）；SPD-10Avp島津高效液相色譜儀（日本Shmadzu公司）；AX205電子天平（瑞士Mettleb Toledo公司）；BP121S電子天平（德國(guó)Sartorius公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 參照文獻(xiàn)[8]，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定。色譜柱為Diamond DIKMA ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈：磷酸鹽緩沖液（5%磷酸調(diào) pH 至3.0）=30∶70，流速為 1.0mL/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為346 nm，進(jìn)樣量20 μL。

2.2 探針的植入 取Wistar大鼠，用20%烏拉坦腹腔注射麻醉（5 mL/kg，腹腔注射），剃除腹部鼠毛，仰位固定于鼠板上。將探針植入大鼠真皮中，滲析窗置于所要采樣的部位。用組織膠將探針入口及出口位置固定。大鼠周?chē)h(huán)境溫度控制在37~39℃[9]。

2.3 在體回收率的測(cè)定 微滲析探針植入大鼠體內(nèi)后，用去離子水作為灌注液，沖洗探針1.5 h。在1.5 h的沖洗期內(nèi)，由于探針的植入而引起的皮膚局部充血、紅腫和皮膚短期增厚可以消除或減少。有文獻(xiàn)[10]報(bào)道在無(wú)毛大鼠活體皮膚內(nèi)植入微滲析探針30 min后，皮膚血流以及組胺水平即可以恢復(fù)到正常值，因此主張微滲析實(shí)驗(yàn)至少在探針植入30 min后才能開(kāi)始進(jìn)行。

沖洗期過(guò)后，依次用 414、621、828、1 040、2 070 ng/mL的鹽酸小檗堿溶液為灌注液，流速設(shè)定為5.0 μL/min，更換灌注液后，在收集下一個(gè)樣品之前，至少有1 h的沖洗期。每間隔30 min收集1次進(jìn)樣，取2次平均值。以滲析液和灌注液中藥物的濃度差為縱坐標(biāo)，對(duì)灌注液中藥物濃度作圖，所得直線的斜率即為探針的回收率。直線的斜率以最小2乘法求得。

2.4 金黃膏大鼠在體經(jīng)皮微滲析實(shí)驗(yàn) 沖洗期過(guò)后，將金黃膏樣品約3 cm2，貼于大鼠腹部剪毛區(qū)，使得探針的滲析窗剛好位于貼片的正下方，給藥9h。于 0~1、1~2、2~3、3~4、4~5、5~6、6~7、7~8、8~9 h 間收集滲析液樣品，注入HPLC系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。

3 結(jié)果與討論

3.1 在體回收率的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[11]，微滲析探針中灌注液的連續(xù)流動(dòng)導(dǎo)致了藥物在組織液和灌注液之間的擴(kuò)散不能完全達(dá)到平衡，藥物在滲析液中的濃度和在組織液中的濃度并不相等。相對(duì)回收率是指在滲析液中的濃度（Cd）和在組織液中的濃度（Cm）的比值，其定義式為：

以Cd-Cp對(duì)Cp作圖，所得直線的斜率即為探針的回收率R，橫軸上的截距為Cm。

根據(jù)相對(duì)回收率的定義式，以滲析液與灌注液中小檗堿的濃度差（Cd-Cp）對(duì)灌注液中的藥物濃度（Cp）作圖，得到線性方程:Cd-Cp=-0.328 1Cp-45.759（r=0.992 5），表明有良好的線性關(guān)系，該方程計(jì)算的回收率為（32.81±1.33）%。

3.2 在體經(jīng)皮微滲析實(shí)驗(yàn) 以金黃膏連續(xù)給藥9 h，測(cè)定滲析液中藥物濃度，圖1是以滲析液中藥物的

式中Cp為灌注液中的藥物濃度。如果Cp=0，即滲析探針中灌注的是空白人工生理溶液 (灌注液)，則公式-1可以改寫(xiě)為：濃度對(duì)取樣時(shí)間間隔的中間點(diǎn)作圖得到的圖線，圖2是滲析液中藥物的累積量對(duì)時(shí)間作圖得到的圖線，對(duì)圖線中的直線部分進(jìn)行回歸,得到Q-t方程：Q＝2．7323t－1．505 6（r＝0．999 6），直線的斜率為滲析液中的藥物透皮吸收的穩(wěn)態(tài)流量（Js），即2.73 ng/h；直線與時(shí)間軸的交點(diǎn)為滯后時(shí)間（Tlag），即1.50 h。

以上藥物的濃度-時(shí)間曲線是在時(shí)間上連續(xù)的藥物濃度監(jiān)測(cè)圖，真實(shí)的記錄了藥物濃度在整個(gè)監(jiān)測(cè)時(shí)間范圍內(nèi)的連續(xù)變化波動(dòng)情況。藥物的累積透過(guò)量時(shí)間曲線也表明了藥物在皮膚內(nèi)有一定的滯留量。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，滲析液中測(cè)得的藥物實(shí)際上是在一定的取樣時(shí)間段內(nèi)的蓄積量，即最終測(cè)得的濃度為取樣時(shí)間段內(nèi)的平均濃度。

微滲析技術(shù)對(duì)組織中藥物的連續(xù)的、不間斷的監(jiān)測(cè)，使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更接近真實(shí)值，更加具有說(shuō)服力，為評(píng)價(jià)藥物療效提供了十分重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

[1] Ault JM,Lunte CE,Meltzer NM,et al.Microdialysis sampling for the investigation of dermal transport[J].Pharm Res,1992,9(10):1256-1261.

[2]Matsuyama K,Nakashima M,Nakaboh Y,et al.Application of in vivo microdialysis to transdermal absorption of methotrexate in rats[J].Pharm Res,1994,11(5):684-686.

[3] Matsuyama K,Nakashima M,Ichikawa M,et al.In vivo microdialysis for the transdermal absorption of valproate in rats[J].Biol Pharm Bull,1994,17(10):1395-1398.

[4] Benfeldt E,Serup PJ,Menne T.Effect of barrier perturbation on cutaneous salicylic acid in human skin:in vivo pharmacokinetics using microdialysis and non-invasive quantification of barrier function[J].Br J Dermatol,1999,140(4):739-748.

[5] Anderson C,Andersson T,Molander M.Ethanol absorption across human skin measured by in vivo microdialysis technique[J].Acta Derm Venereol,1991,71(5):389-393.

[6] 鄭志超,穆 剛.中藥內(nèi)服外敷治療熱痹的臨床觀察[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,30(3):153-154.

[7] 肖學(xué)鳳，喬曉莉，高 嵐，等．黃柏中鹽酸小檗堿的藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27（4）：263－265．

[8] 羅懿妮，賴(lài)宇紅，薛巧如，等．鹽酸小檗堿RP-HPLC測(cè)定條件的比較[J].中藥材，2004，27（9）：647－649．

[9] 丁平田，徐 暉，卞生杰，等．以經(jīng)皮微滲析技術(shù)研究奧旦西酮的大鼠在體經(jīng)皮吸收[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2000，35（4）：305－308．

[10]Groth L.Cutaneous microdialysis methodology and validation[J].Acta Derm Venereol Suppl,1996,197:1-61.

[11]de Lange EC,de Boer AG,Breimer DD.Methodological issues in microdialysis sampling for pharmacokinetic studies[J].Adv Drug Deliv Rev,2000,45(2):125-148.

Preliminary study on permeability of Jinhuanggao by transcutaneous microdialysis in rats in vitro

ZHANG Qian1,YIN Zhong-peng1,ZHAO Hai-nan1,PANG Xiao-chen1,MA Li1,GUO Lin2,LIU Zhi-dong1,WANG Hong2
（1．Tianjin Modern Chinese Medicine Key Laboratory-Province and Ministry Co-established State Key Laboratory Cultivation Base,Tianjin 300193,China;2.Second Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM,Tianjin 300150,China）

[Objective]To study the transcutaneous absorption of Jinhuanggao in rats.[Methods]An in vivo sampling technique and transcutaneous microdialysis were used to determine the drug concentration in dermis in rats.The recovery of the microdialysis probe was adopted to assess in vivo according to the retrodialysis method.[Results]The recovery in vivo was (32.81±1.33)%by retrodialysis method.The steady state flux of berberine hydrochloride in dialysate was 2.73 ng/h,and the lag time was 1.5 h.[Conclusion]The active ingredient in Jinhuanggao has a good retention amount under the skin.So this preparation is suitable for transdermal drug delivery.

cutaneous microdialysis;berberine hydrochloride;transdermal delivery;HPLC

R284

A

1673－9043（2012）03－0151-03

國(guó)家自然基金項(xiàng)目（81072818）。

300193 天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地（張 倩，尹忠鵬，趙海南，龐曉晨，馬 麗，劉志東）300150 天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院（郭 林，王 紅）

張 倩（1987-），女，碩士研究生，主要從事緩控釋制劑的研究。

*通訊作者：劉志東，王 紅。

2012-05-13）